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Nobel 2017 e microscopia crioelettronica

di Giuseppe Alonci

Il premio Nobel per la chimica 2017 è stato assegnato a Jacques Dubochet, Joachim Frank e Richard Henderson per il loro contributo fondamentale allo sviluppo della microscopia crioelettronica, una tecnica che ha permesso di ottenere informazioni preziosissime sulla struttura delle biomolecole e dei componenti del mondo che ci riconda.

 1. Over the last few years, researchers have published atomic structures of numerous complicated protein complexes. a. A protein complex that governs the circadian rhythm. b. A sensor of the type that reads pressure changes in the ear and allows us to hear. c. The Zika virus.

1. Over the last few years, researchers have published atomic structures of numerous complicated protein complexes.
a. A protein complex that governs the circadian rhythm. b. A sensor of the type that reads pressure changes in the ear and allows us
to hear. c. The Zika virus.

In un normale microscopio ottico la luce attraversa il campione per poi passare attraverso una serie di lenti, che quindi trasmettono ai nostri occhi un’immagine ingrandita del soggetto che stiamo esaminando. Usando dei coloranti che si legano in maniera specifica a certe strutture cellulari è possibile visualizzare molti dettagli del micromondo che si sono rivelati fondamentali per il progresso della medicina, della biologia e della chimica.
La microscopia ottica tuttavia soffre di un limite molto pesante: la sua risoluzione massima è di circa 0,2 micrometri, cioè 0,2 milionesimi di metro.
Questo limite non è puramente tecnologico, ma è un limite fisico legato alla lunghezza d’onda della luce impiegata, sebbene in certe condizioni possa a volte essere raggirato (vedi Nobel 2013). Questo impedisce quindi di poter ottenere immagini che abbiano una risoluzione sufficiente per lo studio dei meccanismi molecolari più piccoli e nascosti del vivente, il complesso di proteine e altre biomolecole che costituiscono i nostri ingranaggi biochimici.

mitocondrio osservato in microscopia TEM

mitocondrio osservato in microscopia TEM

Per superare questo limite si deve abbandonare la normale luce visibile per affidarsi a qualcosa di completamente diverso: gli elettroni. La microscopia elettronica assomiglia molto a quella in luce visibile nelle sue caratteristiche generali. Invece dei fotoni (che costituiscono la luce) si utilizzano gli elettroni, che nella microscopia elettronica a trasmissione (TEM) attraversano il campione, passano attraverso una serie di lenti elettromagnetiche e arrivano ad un rivelatore. Come nei microscopi ottici il contrasto è dovuto alla differenza con la quale i tessuti assorbono la luce, così nella microscopia elettronica il contrasto dell’immagine è dato dal differente grado di assorbimento degli elettroni. La differenza è che con gli elettroni si possono ottenere risoluzioni nanometriche, cioè di qualche miliardesimo di metro, cioè nell’ordine delle dimensioni di una macromolecola.
La microscopia elettronica però ha dei difetti che limitano molto il livello di dettaglio che è possibile ottenere studiando campioni biologici: bisogna lavorare in condizioni di altissimo vuoto (cioè a pressioni molto basse) e gli elettroni sono così energetici da poter danneggiare il campione.
Per questi motivi non è possibile utilizzare un microscopio TEM “normale” su un tessuto vivente che non sia stato precedentemente disidratato e sottoposto a una complessa procedura di preparazione e fissazione. Sebbene sia ancora possibile ottenere delle informazioni preziosissime, spesso non è possibile avere alcuna informazione sulla conformazione “originale” di proteine e altre biomolecole (dato che la loro struttura tridimensionale è sensibilissima alle condizioni dell’ambiente circostante), né ovviamente è possibile “vederle” in azione.

Esistono ad oggi molti metodi per determinare la struttura delle proteine, come la cristallografia a raggi X o la spettroscopia NMR.  Entrambe queste tecnologie però hanno dei limiti invalicabili. Nel primo caso la proteina non si trova nel suo stato nativo, ma deve essere cristallizzata. Questo vuol dire isolarla dal suo ambiente naturale e cercare di fare in modo di ottenere un cristallo nel quale ogni molecola di proteina è disposta in maniera ordinata. La spettroscopia NMR, che ci permette di studiare meglio anche la dinamica e la conformazione delle proteine in varie condizioni, ha invece il limite di essere limitata a proteine piccoline. Entrambe queste tecniche inoltre sono lente: è necessario molto tempo per riuscire a ottenere le informazioni desiderate.

diffrattometria a raggi X di una proteina

diffrattometria a raggi X di una proteina


Volendo sfruttare la microscopia TEM per indagare il vivente è necessario superare tre ostacoli:

a) Complessa preparazione del campione;
b) Disidratazione, dovuta alla bassissima pressione all’interno del TEM;
c) Danneggiamento del campione.

Richard Henderson, negli anni ’70, iniziò a cercare degli escamotage per superare questi problemi studiando una proteina, la batteriorodopsina, presente nella membrana di alcuni microorganismi e coinvolta nei processi fotosintetici. La sua strategia consisteva nell’utilizzo non più della proteina isolata, ma di tutta la membrana. Soprattutto, Henderson pensò di utilizzare una soluzione di glucosio per ridurre il problema dell’evaporazione dell’acqua. Questi due accorgimenti furono accompagnati dall’utilizzo di fasci elettronici più deboli, in modo da evitare la distruzione del campione. Le immagini ottenute in questa maniera erano di cattiva qualità, considerando appunto che l’utilizzo di fasci così deboli riduceva di molto il possibile contrasto e aumentava il rumore, ma sfruttando degli accorgimenti particolari e delle tecniche matematiche specifiche riuscì quantomeno a migliorarla.
Tuttavia rimaneva un problema fondamentale: l’immagine ottenuta era bidimensionale, mentre la struttura delle proteine si estende su tutte e tre le direzioni! Per risolvere questo problema, Henderson con i suoi collaboratori “fotografò” la molecola da più angoli diversi fino a riuscire a ottenere un primo modello tridimensionale, che sebbene molto rozzo fu accolto come una straordinaria novità dalla comunità scientifica e pubblicato su Nature nel 1975.

Analisi dell'immagine per strutture tridimensionali, secondo Joachim Frank

Analisi dell’immagine per strutture tridimensionali, secondo Joachim Frank

Qui entra in gioco il lavoro di Joachim Frank, che proprio nel 1975 aveva pubblicato una procedura per combinare più immagini 2D ottenute con il microscopio elettronico in una sola immagine tridimensionale. Questa procedura era estremamente complessa, perché richiedeva di riuscire a distinguere il segnale dal rumore per poi rielaborarlo e trasformarlo in una immagine a tre dimensioni. Quando le proteine sono disposte sulla superficie del portacampioni e sono illuminate dagli elettroni, lasciano una specie di “ombra” sul sensore, che costituisce il segnale che vogliamo ottenere. Dato che le proteine sono disposte in maniera casuale, ognuna di loro lascerà un’ombra diversa.
Tutti quanti abbiamo giocato a fare le ombre con le mani. Immaginate che la sorgente di luce sia una sorgente di elettroni, la vostra mano sia la proteina in esame e il muro il rivelatore del microscopio. Più forte è la luce maggiore è il contrasto tra l’ombra della vostra mano ed il muro. Per ricavare la struttura tridimensionale della vostra mano però non basta una sola immagine, ma ci sarebbe bisogno di guardare la proiezione da differenti angolazioni. Immaginate ora di non essere da soli nella stanza, ma che si siano con voi altre duecento persone con la mano disposta nella vostra stessa conformazione (per esempio quella utilizzata per l’ombra del coniglio), ma che ogni persona abbia la mano girata in maniera casuale: una verso la luce, una verso il muro, una di taglio, una ruotata di 17° e così via. Immaginate inoltre che la luce sia molto debole, per cui il contorno tra ombra e muro non è bello netto, ma molto sfumato. Lo scopo della procedura sviluppata da Frank è di riconoscere ogni ombra di ogni mano, sovrapporre le ombre che provengono da mani con la stessa orientazione in modo da ottenere una immagine più netta e infine combinare tutte le immagini provenienti da tutte le orientazioni per risalire alla struttura tridimensionale. Un bel problema che Frank riuscì a risolvere brillantemente, e che gli permise di pubblicare nel 1980 il modello tridimensionale della superficie di un ribosoma, “l’industria” cellulare coinvolte nella sintesi delle proteine.

High-resolution cryo-electron microscopy structure of the Trypanosoma brucei ribosome

High-resolution cryo-electron microscopy structure of the Trypanosoma brucei ribosome

Nonostante questi due enormi passi avanti, il problema della disidratazione non era ancora risolto. La strategia di Henderson di usare il glucosio non poteva permettere comunque di ottenere dettagli “atomici” e non era applicabile allo studio di proteine solubili in acqua.
Per risolvere questo problema una delle ipotesi che circolavano all’epoca era quella di lavorare a bassissima temperatura, in modo da congelare l’acqua ed evitarne l’evaporazione.
Alla normale pressione atmosferica l’acqua bolle a 100 °C. Quando saliamo in montagna e l’aria si fa più rarefatta il suo punto di ebollizione però è più basso anche di qualche decina di gradi: è il motivo per il qual si dice che in montagna la pasta non cuoce bene!
Per la stessa ragione quando la pressione è bassissima come nel caso di una camera a vuoto, la temperatura di ebollizione può essere anche sotto lo zero!
Il banale congelamento però non va bene per studiare sistemi biologici, dato che la formazione di cristalli di ghiaccio può distruggere le strutture che ci interessa osservare, esattamente per lo stesso motivo per il quale una bottiglia di vetro piena fino all’orlo e messa in congelatore finirà per rompersi in mille pezzi.

Sample-preparation procedure for cryo-EM. Illustration: © Johan Jarnestad/The Royal Swedish Academy of Sciences. The image of a Semliki Forest virus suspension at the bottom is from (57)

Sample-preparation procedure for cryo-EM. Illustration:
© Johan Jarnestad/The Royal Swedish Academy of Sciences. The
image of a Semliki Forest virus suspension at the bottom is from
(57)

È necessario raffreddare in maniera così veloce da non dare nemmeno il tempo alle molecole di acqua di riorganizzarsi in una struttura cristallina, devono essere bloccate istantaneamente nella loro posizione disorganizzata per evitare di distruggere i tessuti circostanti. Questo processo di chiama “vetrificazione”, perché nel vetro le molecole sono disposta in maniera casuale, come in un fluido, invece che in maniera ordinata come nei cristalli.

Ottenere questa “acqua vetrificata” non è stato banale, tanto che se ne parlava già a partire dagli anni ’50, ma ha richiesto anni di impegno da parte di Jacques Dubochet e collaboratori, che alla fine riuscirono a ottimizzare il processo grazie al raffreddamento del campione in etano liquido a -190°C! La tecnica quindi consisteva nel disperdere in acqua il campione, “spalmare” questa dispersione su una sottile reticelle metallica che supportava un film di carbonio, in modo da far restare solamente un sottilissimo straterello di soluzione che poi viene rapidamente raffreddato in etano liquido, che poi può essere visualizzato nel microscopio elettronico lavorando sempre bassissime temperature. Grazie a questa tecnica Dubochet fu in grado di pubblicare su Nature delle celebri immagini di virus nel 1984, un risultato straordinario!
Agli inizi degli anni ’90 quindi grazie agli sforzi combinati degli tre scienziati era stato possibile ottenere immagini eccezionali di campioni biologici, ma nonostante tutto si era ancora ben lontani dal poter arrivare a visualizzare i dettagli di ogni proteina a livello atomico, come Henderson sognava, per ragioni per lo più tecnologiche. La risoluzione infatti era limitata dalla qualità dei detector utilizzati nei microscopi per rivelare gli elettroni e dalla potenza di calcolo delle macchine, che doveva essere sufficiente per elaborare in maniera enormemente complessa milioni di immagini grezze per poter arrivare alla tanto sperata risoluzione atomica.

The electron microscope’s resolution has radically improved in the last few years, from mostly showing shapeless blobs to now being able to visualise proteins at atomic resolution. Image: Martin Högbom.

The electron microscope’s resolution has radically improved in the last few years, from mostly showing shapeless blobs to
now being able to visualise proteins at atomic resolution. Image: Martin Högbom.

È stato quindi solo nel 2013 che grazie a numerosi miglioramenti tecnologici e con l’avvento di una nuova classe di rivelatori, chiamati Direct Electron Detectors, si è finalmente riusciti a ottenere dettagli nell’ordine dell’ångström, cioè del decimo di miliardesimo di metro: abbastanza da osservare nei più piccoli dettagli la struttura molecolare delle proteine!
Grazie a questo immenso lavoro, oggi la microscopia crioTEM sta diventando una tecnica sempre più diffusa in biologia strutturale. Rispetto la cristallografia a raggi X o rispetto l’NMR, permette di ottenere la struttura di proteine e biomolecole in tempi brevissimi e con un livello di dettaglio eccezionale. Questo ha permesso per esempio di ottenere nel giro di qualche mese la struttura tridimensionale del virus Zika, che in Brasile ha purtroppo gravemente danneggiato tanti neonati. Conoscere la struttura dell’avversario che si ha davanti è fondamentale infatti per permettere ai ricercatori di elaborare le strategie più adeguate per combatterlo.

Jacques Dubochet, Joachim Frank and Richard Henderson

Riferimenti:
https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2017/advanced.html
https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2017/popular.html
Immagini: https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2017/press.html

 

 

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