il Tao della Chimica (2° parte)

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RIASSUNTO 1° PARTE:
tao Come i concetti di yin e yang, di antica tradizione taoista cinese, possono essere messi in relazione alle qualità redox di una sostanza chimica o di un prodotto naturale complesso, come un estratto vegetale con funzioni medicinali o anche un alimento.   Numerosi sono i possibili spunti filosofici nell’individuazione di punti dei contatto fra due scuole di pensiero solo apparentemente così distanti, consentendo affascinanti parallelismi e similitudini fra pensiero taoista e chimica.   A partire dallo spunto fornito da un articolo pubblicato da ricercatori cinesi (*), i concetti di yin e yang sono messi in relazione rispettivamente all’intensità rispettivamente del potere antiossidante e proossidante per molte delle erbe utilizzate dalla medicina tradizionale cinese.

(*) Boxin Ou, Dejian Huang, Maureen Hampsch-Woodill e Judith A. Flanagan dei Brunswick Laboratories, Wareham, Massachusetts, USA; “When east meets west: the relationship between yin-yang and antioxidation-oxidation”, ovvero “Quando est incontra ovest: relazione fra yin-yang e antiossidazione-ossidazione”, comparso su The FASEB Journal nel 2002.

Come descritto in un precedente intervento (“gli antiossidanti: dalla pianta all’alimento all’uomo”),  i principali mediatori dell’ossidazione, almeno nei contesti biologici “in vivo” e negli alimenti, sono i noti radicali liberi, atomi o molecole poliatomiche che presentano un elettrone spaiato che conferisce loro caratteristiche di estrema instabilità e reattività nei confronti delle molecole organiche, specie se insature.

radicale libero DPPH - 2,2-difenil-1-picrilidazil
radicale DPPH

Oltre a ciò, i radicali liberi costituiscono un pericolo insidioso per l’integrità composizionale ed indirettamente strutturale delle micro-strutture biologiche anche in funzione del fatto che spesso partecipano a catene di reazioni che oltre ad ossidare i substrati sensibili rigenerano il radicale di partenza, attribuendo pertanto a tali radicali caratteristiche simili a quelle di un catalizzatore.     I radicali perossido, idroperossido e superossido sono le forme radicaliche con le quali più comunemente l’ossigeno atmosferico entra in gioco nel danneggiare ossidativamente le strutture biologiche.
Alcuni fra i test più importanti per valutare le proprietà anti-ossidanti di un prodotto, specie se si tratta di una miscela o di un estratto botanico, è quello di aggiungerlo ad una soluzione di un radicale organico sufficientemente stabile, almeno per il tempo dell’esperimento, come il DPPH o prodotto “in loco” tramite una reazione fra altre specie stabili come nel TEAC-test.   Il risultato è quasi sempre di tipo colorimetrico, ovvero una variazione nell’intensità delle bande di assorbimento legata a variazioni strutturali di almeno parte delle molecole del radicale libero che viene convertito ad una specie stabile diversa, misurabile mediante uno spettrofotometro.

Nel caso del DPPH-test l’attività antiossidante può essere espressa in quantità di antiossidante necessaria per avere una diminuzione del 50% della concentrazione iniziale del radicale (EC50) oppure come tempo richiesto per raggiungere una concentrazione stazionaria del radicale DPPH.
Per il TEAC-test invece il raffronto del risultato è effettuato rispetto al comportamento di una molecola antiossidante standard, il Trolox (un analogo sintetico dei tocoferoli, ovvero della vitamina E), con l’ottenimento di un risultato standardizzato, per quanto relativo: la “capacità antiossidante equivalente”, definita come la concentrazione di Trolox (mmoli L-1) avente capacità antiossidante equivalente a quella di una soluzione 1 mmoli L-1 della sostanza in esame.

Spostandoci più sul campo inorganico esistono anche metodi per la valutazione dell’attività antiossidante basati sulla capacità del prodotto da testare di ridurre il numero di ossidazione di metalli di transizione, come nel FRAP-test dove il complesso tripiridiltriazina (Fe3+-TPTZ), incolore, viene ridotto a (Fe2+-TPTZ), di un intenso colore blu, a bassi valori di pH ad opera di antiossidanti.     Di fatto quello che si va a valutare in questo caso, più che l’effetto antiossidante, è in realtà la capacità riducente del prodotto.

test chimici in vitro su cellula viventi incubate In taluni casi si può arrivare non soltanto a “simulare” il sistema biologico in vitro, ma addirittura a riprodurlo, nel vero senso della parola. Ad esempio sono numerose le pubblicazioni (es. Bin Yang, Akira Kotani, Kensuke Arai, and Fumiyo Kusu – Relationship of Electrochemical Oxidation of Catechins on Their Antioxidant Activity in Microsomal Lipid Peroxidation – Chem. Pharm. Bull. 49(6) 747—751 (2001) ) dove vengono descritti metodi di estrazione (purtroppo da animali da esperimento) di determinate tipologie di cellule, come i microsomi epatici, e la loro incubazione in vitro in condizioni simili a quelle riscontrabili in vivo.   La scelta di questa particolare tipologia di cellule del fegato, torna utile in particolare valutare l’effetto che un antiossidante può esercitare sull’inibizione della perossidazione dei lipidi, compiuta dagli enzimi lipoperossidasi prodotti da queste cellule. Ad esempio si aggiunge dell’acido tiobarbiturico (TBA) ad una coltura di microsomi epatici: in assenza di antiossidanti efficaci le perossidasi portando alla trasformazione del TBA in malonilaldeide (MDA), ma questa reazione di ossidazione può essere efficacemente inibita dalla presenza di opportuni antiossidanti.    La percentuale di inibizione nell’azione delle lipoperossidasi, determinabile appunto sulla base del rapporto TBA/MDA al termine del periodo di valutazione, è uno dei più significativi indici biochimici per la valutazione del potere antiossidante di una molecola in vivo.

Il metodo per la valutazione del potere antiossidante utilizzato dagli Autori cinesi dell’articolo che ho preso come spunto per questa coppia di interventi è un metodo ancora diverso, uno di quelli che si sta affermando come più realistico ed utile negli esiti della sua valutazione, anche se di esecuzione un po’ più elaborata rispetto agli altri: parliamo dell’ORAC-test, dove l’acronimo significa Oxygen Radical Absorbance Capacity.

ficoeritrobilina, il cromoforo rosso della R-ficoeritrina
ficoeritrobilina, il cromoforo rosso della R-ficoeritrina

Il metodo misura la degradazione ossidativa di una proteina fluorescente, la R-ficoeritrina, una ficobiliproteina presente nelle piante e coinvolta insieme alla clorofilla nel complesso meccanismo nella fotosintesi, contenente un pigmento rosso recettore, la ficoeritrobilina (il cui gruppo cromoforo è riportato nel riquadro a lato). L’ossidazione è come di consueto indotta dalla presenza di radicali liberi di tipo perossile a loro volta generati da un iniziatore, l’azo-composto organico in sigla AAPH, in seguito a riscaldamento, mentre la presenza di antiossidanti porta ad un decadimento della fluorescenza misurabile.    Purtroppo questo decadimento non è lineare nel tempo, per cui si richiede la definizione ben precisa di un tempo di inizio ed uno di fine lettura del dato fluorimetrico, l’integrazione dell’area sottesa alla curva fluorescenza(assorbenza)/tempo e, come come accade di consueto per standardizzare questi metodi, il riferimento del dato ottenuto a quello misurabile in analoghe condizioni su un antiossidante standard di riferimento, il giò menzionato Trolox.

spettro di assorbimento e di emissione per la fluorescenza della ficoeritrina
spettro di assorbimento (linea magenta) e di emissione (linea gialla) per la fluorescenza della ficoeritrina

Per approfondire il fenomeno della fluorescenza, le sue relazioni con la struttura delle molecole fluorescenti e la strumentazione utilizzata per la misura dell’emissione fluorescente (i fluorimetri) si suggerisce un rimando all’intervento di cui al link appena evidenziato.

Alcuni valori di attività antiossidante “per porzione” di alimento, valutata per mezzo dell’ORAC-test:

piccolo fluorimetro da laboratorio
fluorimetro

– Mirtillo (1 tazza): 8983
– Foglie di carciofo (cotte, 1 tazza): 7904
– More (coltivate, 1 tazza): 7701
– Prugna (mezza tazza): 7291
– Mela rosso Delicious (1 mela): 5900
– Faglioli neri (mezza tazza, secchi): 4181

L’ORAC-test, insieme ad altri test, basati sullo stesso principio della variazione della fluorescenza in seguito all’ossidazione di un substrato proteico, forse anche per le condizioni piuttosto “soft” richiesti per la loro applicazione (non sono necessarie condizioni fisiche e sostanze chimiche incompatibili con la vita) sono stati proposti e collaudati, seppur in modo opportunamente adattato, per la valutazione della “tenuta” ossidativa anche di matrici biologiche in vivo, ad esempio del plasma sanguigno direttamente sul soggetto da esaminare.    Ad esempio una metodica relativamente simile, il TRAP-test (che però sfrutta il ABAP come generatore di radicali), è utilizzato per la determinazione dell’attività antiossidante totale nel plasma sanguigno.
Alcuni detrattori dell’effetto fisiologico “in vivo” delle più comuni molecole indicate come antiossidanti (proprio a partire dagli stessi polifenoli) hanno iniziato ad accumulare prove che evidenziano una forte discrepanza fra gli esiti di un po’ tutti i metodi per la valutazione dell’effetto antiossidante, proprio ad iniziare dell’ORAC-test effettuato in vitro, ovvero con tutte le sostanze coinvolte “in provetta”, e quello effettuato in vivo, ovvero direttamente sui fluidi biologici in circolo nel corpo umano come il sangue e la sua frazione plasmatica, dopo che il paziente ha assunto questi antiossidanti tramite l’alimentazione.   Alla base della discrepanza sembrerebbero esserci problematiche legate all’assimilazione di queste molecole, che non passerebbero così facilmente dall’apparato digerente al circolo sanguigno, ed alle restanti proprietà ADME che non favorirebbero a quanto pare una sufficiente permanenza della forma originaria, non ossidata e quindi attiva nelle sue qualità antiossidanti.   frutta e verdura fresche   Secondo tali Autori gli unici antiossidanti assunti con l’alimentazione che continuerebbero di fatto a svolgere azione antiossidante anche “all’interno” dell’organismo sono per l’appunto le note vitamine con effetto antiossidante: A, C, E.   Tutto questo suggerirebbe di provare a cercare spiegazioni alternative che vadano oltre all’effetto antiossidante diretto ed un po’ meccanicistico che molti attribuirebbero ai più diffusi antiossidanti di origine naturale, approfondendo gli studi relativi alla loro reattività nel senso più globale del termine, all’interno della realtà così complessa e strutturata come quella rappresentata dall’organismo umano.

Altri metodi, utili soprattutto nel contesto dei fluidi biologici come ad esempio nel plasma sanguigno, sfruttano una variazione nella fluorescenza misurabile tramite fluorimetri in relazione all’ossidazione di particolari substrati proteici (es. TRAP-test, ORAC-test).

Operando nel vasto campo delle sostanze organiche naturali, ed in modo specifico dei prodotti fitoterapici, le molecole polari ed almeno in parte idrosolubili con più marcate proprietà antiossidanti sono molto spesso ascrivibili alla grande classe dei polifenoli.   Sono noti in natura sull’ordine delle diverse centinaia di diverse specie chimiche di tipo polifenolico, se si includono anche i loro glucosidi (dove il polifenolo è legato chimicamente ad una parte di un carboidrato), e una stessa specie vegetale ne può contenere eventualmente anche una dozzina di specie chimiche diverse, alcune delle quali potrebbero persino non essere note o non essere disponibili in forma di standard puro, condizione questa essenziale per poter procedere con un tradizionale approccio analitico di tipo separativo-identificativo-quantitativo (es. HPLC-UV)
In considerazione di tutti questi fattori, risulta spesso più pratico e non meno utile per molte finalità concrete il misurare globalmente la concentrazione complessiva di polifenoli in un prodotto, attraverso il test colorimetrico di Folin-Ciocalteu: dopo l’aggiunta di opportuni reattivi (a base di fosfomolibdato e fosfotungstato di sodio) in grado di reagire genericamente con il gruppo funzionale fenolico (ma ahimè anche in una certa misura con altri agenti riducenti!), la soluzione analitica assume una colorazione blu di intensità proporzionale alla concentrazione stessa dei fenoli.    Questa colorazione può essere misurata sperimentalmente mediante uno spettrofotometro, correlando sul piano matematico l’assorbanza della soluzione con la concentrazione di fenoli totali mediante una retta di regressione.    Il valore numerico così ottenuto è l’indice di polifenoli (IP), espresso in mg/kg, che tuttavia nulla ci dice circa la reale composizione della miscela, e neppure circa il livello di attività antiossidante di questa, anche se è logico pensare che a parità di altre condizioni (ad esempio parlando sempre di polifenoli, e possibilmente della stessa tipologia, ad esempio perché derivanti dalla stessa specie vegetale) l’attività antiossidante sia in qualche modo proporzionale all’IP.   Inoltre dal momento che ogni singolo polifenolo che può comporre la miscela complessa avrà una sua risposta specifica, più o meno intensa a parità di concentrazione, si è soliti riferire il responso al corrispondente equivalente di acido gallico (GAE), uno dei fenoli di origine vegetale più ubiquitari in natura.

Radix codonopsis (Codonopsis pilosula) - pianta yang-tonica
Codonopisis pilosula - radice yang-tonica (ORAC 47 micromoli trolox/g; IP 4.5 mg GAE/g)

La stessa pubblicazione degli autori cinesi più volte citati evidenzia proprio come il valore di IP che indica il contenuto fenolico totale e la capacità antiossidante (misurata con ORAC-test) vadano in effetti nella stessa direzione passando dalle erbe più Yin-toniche a quelle più Yang-toniche, ma confrontando le due serie di numeri non è affatto possibile trovare una correlazione precisa fra i due.    Il Rizoma coptidis per esempio mostra una capacità antiossidante ORAC di 855 micromoli TE/g, molto maggiore rispetto a quella che sarebbe eventualmente prevedibile sulla base del suo contenuto fenolico di 17.8 mg GAE/g, specie se si tiene conto che altre erbe esaminate nello stesso studio, per così dire “più vicine ad una retta di regressione ORAC/IP” mostrano come il Flos Chrysanthemi una ORAC di 525 micromoli TE/g conto un IP di 25.0 mg GAE/g.

Volendo è pur sempre possibile andare a separare uno per uno tutti o almeno parte dei componenti antiossidanti, fenolici o non fenolici, di una miscela naturale, così come i principi proosidanti, mediante una appropriata tecnica di separazione, idealmente tramite HPLC preparativo o comunque attraverso altre tecnica cromatografica liquida non distruttiva.
Sulle singole molecole isolate, oltre a tutti i test genericamente validi per quantificare il potere antiossidante, possono essere condotti ulteriori studi di tipo elettrochimico, come ad esempio la voltammetria ciclica, che porteranno alla definizione del potenziale di semi-onda (E1/2) relativo alla reazione di ossidazione della molecola di antiossidante, in completa analogia con i metodi di studio per le tradizionali reazioni redox sia inorganiche che organiche.
Un altro parametro di descrizione di una reazione redox applicabile anche nel contesto della reazione fra un agente ossidante ed un antiossidante naturale è il numero “n” di elettroni che possono essere scambiati nel primo step ossidativo: non bisogna dimenticare infatti che molti antiossidanti, specie quelli di natura polifenolica, essendo provvisti di più di un sito ossidabile (nel caso specifico gli –OH fenolici) posso andare incontro a diversi stadi di ossidazione, con potenziale di semionda via via in riduzione fino ad arrivare alla molecola completamente ossidata, di solito ad una forma chinonica eventualmente polimerizzata.

Radix Scutellariae (Scutellaria baicalensis) - yin
Scutellaria bailcalensis - radice yin-tonica (ORAC 1684 MICROMOLI TROLOX/G; IP 85.0 MG GAE/G)
Da quanto precedentemente descritto, si evince che quelli per la capacità (o potere, o effetto) antiossidante di una molecola o di una miscela, più che metodi di misura, oppure metodi di stima (che pressupporrebbero comunque un valore oggettivo, per quanto non conosciuto, da approssimare mediante calcolo) sono metodiche per la “valutazione”.

Fondamentale per la visione taosita dell’esistenza è il valore riconosciuto all’equilibrio, in senso lato e nello specifico fra Yin e Yang.   Non vi sono connotazioni morali fra i due componenti: per quanto essi possano essere associati rispettivamente anche alla morte ed alla vita, tali concetti non possono in alcun modo essere confusi con il male ed il bene.   Sarebbe fin troppo facile quanto scorretto e fonte di gravissimi squilibri perseguire la riduzione dello Yin a favore del solo Yang.
Purtroppo alcune frange della cultura occidentale faticano ancora molto a comprendere e fare propria la complessità della valorizzazione degli equilibrii.   Mentre da un lato si accettano comunemente proverbi come “il troppo storpia” e “l’equilibrio sta nel mezzo”, vedo che presso la cultura popolare americana in particolare espressioni come “hai fatto la scelta giusta” nascondono spesso una eccessiva semplificazione morale di dicotomie solo apparenti fra opposti tutt’altro che incompatibili fra loro.   Quando la comunità scientifica ci fa sapere che troppi carboidrati fanno ingrassare, allora la reazione della maggior parte delle persone è quella di cercare di eliminarli il più possibile dall’alimentazione, dimenticando che essi sono in realtà in carburante essenziale per il nostro organismo, così pure come il sodio attualmente criminalizzato nelle acque in bottiglia, che invece costituisce uno degli elettroliti essenziali più abbondanti ed irrinunciabili per il nostro organismo, per non parlare dei grassi che oltre a rappresentare “per natura”, immediatamente dopo i carboidrati, una delle fonti energetiche essenziali nell’alimentazione, sono veicoli di indispensabili principi nutritivi di dettaglio, le vitamine liposolubili (diverse delle quali, seppur non trigliceridi, possono a ragione essere ascritte loro stesse all’interno del termine “grassi”), in assenza delle quali andremmo incontro a scompensi ben più gravi rispetto a quelli derivanti da qualche chilo di peso corporeo in più.

Tornando alla connotazione Yin e Yang delle proprietà pro-ossidativa ed anti-ossidativa e facendo tesoro della lezione sul perseguimento dell’equilibrio che ci deriva dal Tao, giungiamo a questo punto facilmente alla comprensione del fatto che l’ossidazione non può essere in nessun modo vista come un male da evitare, o comunque da limitare e procrastinare nel tempo. E questo per un semplicissimo motivo: essa costituisce la base stessa della vita, almeno così come essa si svolge sul nostro pianeta e per gli organismi superiori.
Il catabolismo che porta alla produzione di energia a partire dai carboidrati, dai lipidi o dalle altre molecole di origine naturale sulle quali si basa la nostra alimentazione, nonché il concetto stesso di respirazione cellulare, sono tutti processi biochimici che possono tranquillamente essere intesi come forme complesse di ossidazione: dalla glicolisi al ciclo di Krebs, con tutte le varianti previste dai vari organismi aerobi, giù giù fino alla catena di reazioni nota come fosforilazione ossidativa, o catena di trasporto degli elettroni, che al suo termine cede questi elettroni ormai “depotenziati” all’ossigeno molecolare che quasi “pietosamente” li raccoglie per formare acqua.

Mentre l’ossidazione può quindi essere intesa come il destino “naturale”, per quanto talvolta solo in potenza, di una molecola organica, l’anti-ossidazione può al contrario essere interpretata dal punto di vista globale come un rallentamento, un’alternativa per quanto transitoria e paliativa, un piccolo ostacolo posto lungo un processo che con i suoi innumerevoli e mutevoli stadi assume complessivamente il carattere di ossidazione.
Da qui la metafora del fiume, alla quale sono arrivato proprio scrivendo queste pagine: se il decorso ossidativo può essere immaginato come un fiume che riporta le acque dolci dei ghiacciai e della pioggia giù giù fino al mare, l’antiossidazione rappresenta tutti quei fattori che contribuiscono a rendere meno impetuoso questo decorso.   fiume irruento - metafora del decorso yang-ossidante se incontrastato Un fiume irruento, di ampia portata ma soprattutto troppo “diretto” verso la sua foce, come un torrente che scorre lungo la linea di massima pendenza da una montagna che si affaccia a picco sul mare, non è un bene nel contesto ecologico: le sue acque non vengono sufficientemente godute come risorsa dalle specie che vi vivono accanto, i pesci al suo interno non hanno vita facile, e inoltre le sue sponde sono erose, gli alberi sradicati e la geologia stessa dei terreni limitrofi pesantemente perturbata, fino al rischio di indurre in un modo o nell’altro cambiamenti sul fiume stesso, come ad esempio la variazione del suo corso, per spostamento graduale o improvviso del letto.   In questo esempio l’antiossidazione può essere intesa come la valle dove il fiume rallenta, il bacino dove l’acqua si raccoglie in un lago, per poi comunque defluire all’estuario più a valle; la diga, la vegetazione che affonda le radici lungo le sue sponde. Non possiamo rallentare troppo il decorso del fiume: il rischio sarebbe quello di creare paludi, acque stagnanti, atmosfere umide e putrefazione: tutte queste caratteristiche possono in un modo o nell’altro essere intese come conseguenze estreme dell’eccesso di Yin, e guarda caso le molecole che si formano in questo contesto (vedi il post: “la chimica della putrefazione”) sono molecole fortemente riducenti, ovvero l’opposto di ossidanti, oltre che intensamente venefiche.
Ancora una volta si arriva quindi al principio secondo il quale Yin e Yang sono opposti e complementari sì, ma reciprocamente compenetrati e la vita, che in quanto viventi non possiamo che intendere questa sì come il bene, richiede entrambe, nella giusta misura e nel giusto equilibrio, per potersi conservare.

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