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Oltre le molecole: chimica, vita, complessità

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di Giuseppe Alonci

I diversi ordini di grandezza della materia: 1. Materia (macroscopico); 2.Struttura molecolare (atomi); 3.Atomo (neutrone, protone, elettrone); 4.Elettrone; 5.Quark; 6.Stringhe

Diversi ordini di grandezza della materia

Dalla prima particella a un embrione umano, da un insieme disordinato di atomi a un computer, il cammino dell’evoluzione ha sempre seguito la traccia della complessità. Cosa rende un insieme di molecole un essere vivente? Quando è che la materia diventa pensante? Questi interrogativi che la natura pone al filosofo e allo scienziato richiedono di cambiare completamente la nostra prospettiva su ciò che ci circonda. Poniamoci una domanda ulteriore: cosa porta miliardi e miliardi di molecole ad auto-organizzarsi in un’entità dotata di proprietà completamente diverse da quelle dei suoi materiali costituenti? Questa è una domanda su cui il chimico deve riflettere seriamente, poiché rivela che c’è una zona grigia tra la biologia – cioè lo studio del complesso, lo studio del vivente – e la chimica, che invece sembra limitarsi a studiare come gli atomi si legano e si scambiano tra di loro e come trovare nuove strategie per combinarli. Questa zona grigia, che studia come le molecole interagiscono tra di loro, come si organizzano autonomamente nello spazio, è la chimica supramolecolare.

Il chimico del nostro secolo è, di fatto, un ottimo “artigiano molecolare”. Creatività, fantasia e una cassetta degli attrezzi piena di reazioni, metodi di analisi e di purificazione, progetti, disegni e schizzi, gli permettono la sintesi di praticamente qualsivoglia molecola. Questo può essere fatto rompendo e formando accuratamente i legami che ne tengono insieme gli atomi. Ma se vogliamo veramente comprendere meglio il mondo vivente questo non ci basta: non sono più gli atomi ad essere i nostri materiali da costruzione, ma le molecole! Questo vuol dire spostare completamente il nostro punto di osservazione dai legami tra gli atomi, detti primari, a i legami tra le molecole, detti secondari e molto più deboli.

 

Qualche esempio

Per capire meglio quali sono le sfide che il chimico supramolecolare deve affrontare, proviamo ora a introdurre alcuni dei problemi che hanno portato alla nascita di questa disciplina. Nei paragrafi seguenti, dopo aver rivisto alcuni concetti fondamentali sul legame chimico, cercheremo di capire in che modo la ricerca sta rispondendo a questi quesiti e quali risultati sono stati raggiunti.

accoppiamento tra due basi azotate coniugateTutta l’informazione necessaria per lo sviluppo completo di un organismo è contenuta nel suo DNA. Il DNA è sostanzialmente una enorme gigantesca molecola, formata da due eliche intrecciate tra di loro, ognuna delle quali non è che un susseguirsi di piccole molecole legate tra di loro, in particolare zuccheri, ioni fosfato e le famose basi azotate: adenina, timina, citosina e guanina (per approfondire: “struttura degli acidi nucleici: varianti“). Ogni base su una elica si accoppia sempre con un’altra base nell’altra elica: adenina (A) con timina (T) e citosina (C) con guanina (G). Questo vuol dire che se un elica ha sequenza ATTGCCGTA l’altra deve avere come sequenza TAACGGCAT. A cosa è dovuto questo fenomeno? Cosa è ad impedire che le due eliche si srotolino liberamente? Vedremo più avanti che la complementarità tra le basi è dovuta a un tipo particolare di interazione tra molecole, il legame a idrogeno. Questa interazione è molto forte e contribuisce anche a tenere unite assieme le due eliche. Un altro fattore importante di stabilizzazione è la presenza di una serie di interazioni, chiamate di π-stacking (“impilamento π”) tra basi azotate che fanno parte dello stesso filamento. A questo va ad aggiungersi l’effetto di numerose proteine, dette istoni, che favoriscono il corretto ripiegamento della doppia elica all’interno del nucleo.

Una delle caratteristiche fondamentali di ogni essere vivente, dal Mycoplasma genitalium – uno dei batteri più piccoli – fino ad un elefante, è quella di avere dei bordi definiti che lo separano dall’esterno. Può essere una sottile membrana cellulare, come nel caso delle cellule animali, o una spessa parete come nel caso delle cellule vegetali o di buona parte dei batteri. Queste permettono di contenere in uno spazio ristretto i nutrienti, l’informazione genetica e tutti gli ingranaggi molecolari che permettono la vita dell’organismo, al contempo difendendolo dall’esterno.

La membrana cellulare è uno dei sistemi biologici più studiati ed è di una complessità veramente formidabile. È costituita da un doppio strato di grassi in cui sono immerse una enorme quantità di proteine che ricoprono numerose funzioni biologiche fondamentali. Tutto ciò è tenuto assieme esclusivamente da forze deboli, che riescono a garantire alla membrana stabilità ma anche flessibilità, necessaria per adattarsi all’ambiente circostante. Come è stato possibile che queste tutte queste molecole così complesse e così incredibilmente diverse abbiano deciso, tutte in una volta, di organizzarsi autonomamente per formare una membrana cellulare? Per un profano che si avvicina alla biologia, è quasi chiedersi come sia possibile che tutto questo si sia autonomamente e spontaneamente auto-organizzato senza un qualche tipo di intervento divino. Come vedremo più avanti, non solo è possibile, ma strutture molto simili alle membrane cellulari si formano autonomamente in una serie di condizioni che si verificano puntualmente ogni giorno all’interno delle nostre case!

Un altro aspetto fondamentale è la comprensione della struttura delle proteine e del modo in cui interagiscono tra di loro e con le altre molecole che circolano nel nostro organismo. Le proteine svolgono moltissime funzioni diverse, tutte quante assolutamente fondamentali: hanno funzioni di sostegno (collagene), possono servire a catalizzare, cioè rendere più veloci e selettive, certe reazioni chimiche (come tutte le migliaia di proteine legate al metabolismo), possono avere funzioni regolatorie (come quelle che si legano al DNA accendendo o spegnendo uno specifico gene), possono servire a far comunicare la cellula con l’esterno (recettori, canali e proteine di membrana) e tantissime altre funzioni ancora. Le proteine vengono prodotte nei ribosomi, piccoli organelli presenti in grande quantità nelle nostre cellule e tra i più complessi esempi di architettura supramolecolare esistenti in natura. Il corretto funzionamento delle proteine e la loro capacità di legarsi ad altre proteine o a piccole molecole e anch’esso legato a interazioni deboli. Le struttura di una proteina è normalmente divisa in quattro livelli:
– La struttura primaria è determinata dalla sequenza di amminoacidi che la compongono, legati tra di loro da legami primari;

– La struttura secondaria consiste nel modo in cui questa catena di amminoacidi è arrotolata su sé stessa: la catena può essere lineare, può andare avanti e indietro “coprendo” una parte di piano (struttura detta foglietto β) oppure possono arrotolarsi come un’elica (α-elica);

– La struttura terziaria è determinata da come queste strutture secondarie si organizzano tra di loro nello spazio. Per esempio, possono attorcigliarsi per formare dei gomitoli (proteine globulari), delle fibre, possono formare delle ciambelle (come nelle proteine canale) e così via;

– Infine abbiamo una struttura quaternaria che si forma quando più subunità interagiscono tra di loro.

dalla struttura primaria alla quaternaria delle proteineSebbene sembri una cosa particolarmente complessa e oscura, in realtà comprendere la natura di queste strutture è abbastanza facile. Immaginiamo un cavo come quelli “a molla” che collegano la cornetta al telefono fisso. In questo esempio, il cavo in sé è la struttura primaria. In una proteina invece di essere tutto di un solo colore sarebbe composto da un susseguirsi di 20 colori, corrispondenti ai 20 amminoacidi. Il cavo si arrotola su sé stesso a formare un elica (α-elica, struttura secondaria). Se il cavo è lungo, le eliche si intrecciano tra di loro e formano dei gomitoli di eliche (struttura terziaria). Se il cavo è molto lungo, si possono formare più gomitoli che si intrecciano assieme (struttura quaternaria).

Al contrario del cavo del telefono, la struttura tridimensionale delle proteine è univocamente determinata e non è casuale. Guai se lo fosse! Quando le proteine si ripiegano male insorgono gravissime malattie, come l’encefalopatia spongiforme bovina (la mucca pazza), l’Alzheimer e la Corea di Huntington.

Queste conformazioni sono legate proprio alla presenza di legami secondari. Come il DNA era stabilizzato dai legami ad idrogeno tra le basi azotate e da altre forze intermolecolari (cioè tra molecole diverse), così le catene di amminoacidi si arrotolano tra di loro in base alla presenza di legami a idrogeno e ad altri tipi di interazione di cui parleremo più avanti. Questa struttura tridimensionale è fondamentale perché una proteina svolga la sua azione. Il modo in cui una proteina si lega al substrato (cioè alla molecola sulla quale deve agire) è infatti un meccanismo a chiave-serratura: la proteina è come una serratura che, attraverso dei legami secondari, riconosce la chiave corretta.

Uno degli esperimenti più belli e più motivanti degli ultimi anni è stato sicuramente l’assemblaggio in provetta di un virus, il virus del mosaico del tabacco (TMV). Questo è formato da una lunga catena di RNA circondata da proteine. Isolando l’acido nucleico e le proteine e rimettendole insieme, il virus si riforma di nuovo, con un meccanismo di auto-assemblaggio complesso ma efficace.

Lo stesso esperimento può essere ripetuto anche con i ribosomi. Il loro compito è estremamente complesso: devono infatti interpretare correttamente le istruzioni del DNA (che vengono loro trasmesse dall’RNA) e sintetizzare le proteine che vengono richieste. La cosa interessante è che anche i ribosomi sono formati da un insieme di proteine, ben cinquantacinque, più tre molecole di RNA transfer, che si sono auto-organizzate in una vera e propria macchina molecolare. Proteine che sintetizzano proteine! Anche in questo caso se tutti i componenti vengono isolati, purificati e poi riuniti assieme in provetta nelle condizioni opportune, ritornando spontaneamente allo stato iniziale e non solo: funzionano anche!
Per comprendere meglio cosa c’è dietro tutto queste dobbiamo però capire meglio quali sono queste forze che permettono questi fenomeni.

esempio di macchina molecolare

esempio di macchina molecolare

I legami chimici possono essere primari o secondari

Innanzi tutto dobbiamo precisare che esistono due tipi di legame chimico: i legami primari, molto forti, che tengono insieme gli atomi all’interno delle molecole, e i legami secondari, che agiscono tra una molecola e l’altra e sono, in genere molto più deboli (per approfondire: “che cos’è un legame chimico?“).

Un esempio semplice che illustra questa differenza è l’acqua. Tutti noi sappiamo che la formula chimica dell’acqua è H2O. Nel linguaggio dei chimici, questo vuol dire che una singola molecola di acqua è composta da un atomo di ossigeno a cui sono legati due atomi di idrogeno. Il tipo di legame che tiene uniti ossigeno e idrogeno è un legame primario e richiede temperature nell’ordine delle migliaia di gradi per essere spezzato.

Ogni singola molecola d’acqua però interagisce anche con le altre molecole che le stanno vicino. Questi sono i legami secondari, interazioni deboli ma che, come forse ricorderete dalla scuola secondaria, sono responsabile delle caratteristiche dei tre stati fondamentali della materia:

– Solido, nel quale le interazioni tra le molecole sono molto forti. La forza di questi legami è tale che le molecole sono bloccate in una posizione ben definita, quasi immobili;

– Liquido, nel quale le forze intermolecolari (cioè tra una molecola e l’altra) sono abbastanza forti da trattenerle in un volume ben definito ma non sufficienti a renderle immobili e bloccate in una certa posizione. Mentre in un solido ogni particella occupava una posizione definita, nel liquido ogni molecola può viaggiare liberamente nel volume disponibile;

– Gassoso, nel quale le interazioni tra una molecola e l’altra sono così deboli che possiamo considerare le particelle come tante entità indipendenti l’una dall’altra. Ogni particella si comporta come un piccolo razzo, “propulso” dall’energia termica.

Questa piccola introduzione ci fornisce l’opportunità per riflettere su due argomenti di fondamentale importanza per il prosieguo di questo articolo.

In primis dobbiamo ricordarci che sebbene i legami secondari siano molto più deboli di quelli primari ciò non vuole dire che siano meno importanti per determinare le proprietà del mondo che ci circonda.

Di questi, i più importanti sono i legami a idrogeno. Senza entrare nei dettagli, questa è la tipologia di legame secondario più importante. È così importante che mentre l’acqua, H2O, bolle a 100°C, l’acido solfidrico, H2S, bolle a -80°C. Questa differenza incredibile nelle proprietà fisiche in molecole tutto sommato molti simili – l’unica differenza è lo scambio di un ossigeno con un atomo di zolfo – è dovuta al fatto che le molecole d’acqua sono tenute assieme da un numero innumerevole di legami a idrogeno, mentre in H2S questi legami sono poco importanti.

La possibilità di formare o no dei legami secondari ha inoltre un riflesso importante nella capacità di molecole diverse di interagire tra di loro. L’etanolo, il comune alcool, è perfettamente solubile in acqua, così come l’acetone per le unghie. Questo perché le molecole di alcool o di acetone possono interagire con quelle di acqua in maniera favorevole, cioè possono formare dei legami con le molecole di acqua. Una molecola, come l’alcool o l’acetone, che interagisce favorevolmente con l’acqua, si dice idrofila. L’olio, al contrario, è idrofobo: le sue molecole non possono formare legami secondari con l’acqua e di conseguenza tendono a legarsi tra sé stesse. Funziona come nel mondo umano: quando due gruppi di persone hanno molte cose in comune e molte affinità tendono a integrarsi tra di loro, quando hanno idee e posizioni diverse e non negoziabili i due gruppi rimangono separati (in realtà questo esempio è fin troppo ottimistico: quando si mescolano olio e acqua ognuno rimane per contro proprio, non fanno esplodere la cucina).

Un secondo punto importante è il fatto che, con i diversi stati della materia, per la prima volta siamo davanti a delle proprietà emergenti. Una proprietà si dice emergente quando è una caratteristica di un insieme di elementi che non era presente in quegli elementi stessi. Nessuno di noi si fermerebbe ad ammirare un mattone, né lo considererebbe degno di particolare attenzione (tranne forse qualche appassionato di arte moderna), ma tutti noi lavoriamo una vita per poterci permettere una casa. L’essere “casa” è una proprietà emergente. Un singolo mattone non è casa, nemmeno due, nemmeno tre, e non lo è nemmeno un sacco di cemento: è tutto l’insieme che acquisisce un valore. Allo stesso modo l’essere solido, liquido o gas è una proprietà emergente: una singola molecola non è né liquida, né solida né gassosa, è l’insieme di un enorme numero di particelle ad acquisire quelle proprietà che poi ci portano a classificarlo in uno degli stati noti. Anche la vita è una proprietà emergente: una molecola, due molecole, tre molecole, un milione di miliardi di molecole non sono vita, come un cumulo di mattoni non è una casa. È necessario qualcosa di più. Ma di questo ne parleremo meglio più avanti.

 

Detersivi, sporcizia e membrane cellulari

Ora che ci siamo dotati di alcuni strumenti fondamentali possiamo provare a vedere davvero come lavora la chimica supramolecolare e come può permetterci di indagare il mistero più profondo: la vita.

Come abbiamo visto tra gli esempi proposti, la membrana cellulare riveste una moltitudine di ruoli: protegge la cellula dalle sostanze indesiderate da una parte, e dall’altra permette il passaggio dei nutrienti, dell’acqua, permette alla cellula di comunicare con il mondo esterno, di “chiacchierare” con le altre cellule, di reagire gli stimoli e così via. Inoltre una membrana nucleare separa e protegge il DNA dal citoplasma e tutta la cellula è percorsa in continuazione da una varietà di organelli e vescicole, come endosomi, lisosomi e vacuoli. Riuscire a progettare un sistema che possa mimare tutte queste “architetture molecolari” è un compito arduo ma fondamentale, dato che è da questo che dipende la nostra comprensione del corpo umano, lo sviluppo di farmaci sempre più efficienti e mirati verso un target ben definito.

La membrana cellulare è formata da un doppio strato fosfolipidico in cui sono immerse molte proteine di membrana e altre molecole, come il colesterolo. Dato che l’espressione “doppio strato fosfolipidico” per alcuni può non voler dire molto, cerchiamo di analizzarla termine per termine.

fosfolipide di membranaUn fosfolipide è una molecola che contiene una lunghissima catena di carbonio e una testa formato da uno ione fosfato. Come dice il nome, li possiamo considerare come dei derivati degli acidi grassi (lipidi). La cosa interessante è che sono molecole anfifiliche. Questo vuol dire che sono affini sia all’acqua (idrofile) sia ai grassi (lipofile): la testa è la parte idrofila mentre le lunghe catene carboniose sono lipofile. Questo ha una conseguenza importante.

Quando pongo in acqua una molecola la situazione è infatti un po’ particolare, in quanto da una parte la testa vuole essere a contatto con l’acqua mentre la coda vorrebbe trovare una bella gocciolina d’olio o di qualche altro grasso a cui attaccarsi. Se questo grasso si trova disperso nelle mani di un bambino che ha appena finito di giocare a palla con gli amici, ecco che abbiamo ottenuto un… sapone! Il sapone infatti è composto proprio da molecole anfifiliche che con la coda si legano allo sporco e con la testa interagiscono con l’acqua circostante. Le molecole di sapone si organizzano in micelle, cioè delle vescicole composte da un guscio di teste idrofile mentre le code sono tutte dirette verso l’interno, dove c’è la particella di grasso. A questo punto la micella è idrofila, dato che l’acqua interagisce solo col guscio esterno, e normalmente finisce nello scarico del rubinetto portandosi dietro il suo tesoro di grasso. Questo fenomeno è un esempio di self-assembly, cioè di auto-assemblaggio. Non c’è stato bisogno di nessun intervento divino o di nessuna magia: le molecole si sono autonomamente organizzate per formare una struttura geometrica altamente ordinata, spinte solo dalla termodinamica. Organizzandosi in micelle le molecole di sapone hanno abbassato l’energia complessiva del sistema, passando da uno stato di instabilità, in cui una parte della molecola era costretta a delle interazioni sfavorevoli con l’acqua, ad uno stato di stabilità.

micelle e liposomiFin ora quindi abbiamo imparato che la membrana cellulare è formata da fosfolipidi, che i fosfolipidi sono molecole anfifiliche e che le molecole anfifiliche tendono a organizzarsi autonomamente in micelle in presenza di acqua e di un grasso. In una cellula però tutto questo “sporco” non c’è! L’interno della cellula è comunque composto prevalentemente di acqua: la micella non può funzionare! Come possono organizzarsi allora le nostre molecole? Possono formare un liposoma. In un liposoma le molecole anfifiliche formano un doppio strato. Questo vuol dire che abbiamo un primo guscio di molecole, con le code rivolte all’esterno e le teste all’interno, e un secondo strato in cui avviene il contrario, cioè le code sono all’interno e le teste all’esterno. Questo permette a tutte le code di trovarsi in un ambiente lipofilo, mentre le teste in uno idrofilo. Il liposoma non è che la versione morta di una cellula! Micelle e liposomi sono quindi dei possibili modelli per la membrana cellulare. La ricerca in questo senso procede su più fronti.

dalla cellula al fosfolipideUn loro primo utilizzo può essere quello di aiutarci a isolare, purificare e comprendere meglio le proteine di membrana. Una proteina di membrana può svolgere moltissimi compiti. Le acquaporine permettono il passaggio dell’acqua fuori e dentro la cellula, le pompe ioniche permettono di mantenere la concentrazione desiderata di ioni dentro e fuori la cellula (molti di voi probabilmente ricorderanno le famose pompe sodio-potassio), altre permettono il passaggio di nutrienti e farmaci, altre sono recettori di ormoni, altre servono a riconoscere la presenza di altre cellule o di ospiti indesiderati, altre servono a comunicare con l’estero. Questo vuol dire che conoscere esattamente la struttura, la funzione e il meccanismo di azione di queste macromolecole è fondamentale per la medicina, dato che da una parte possono essere il target di moltissime classi diverse di farmaci – dagli antidolorifici agli antitumorali – e dall’altra un loro malfunzionamento è legato a moltissime condizioni patologiche. Per avere tutte queste informazioni è però necessario prima estrarle e purificarle, in modo poi da poterne determinare la struttura grazie a tecniche di indagine come la risonanza magnetica nucleare (NMR) o la diffrazione a raggi X (XRD). Tuttavia questo processo di purificazione è estremamente difficile. Una proteina di membrana è infatti anch’essa una molecola anfifilica. Da una parte infatti deve essere in grado di interagire con la membrana cellulare, lipofila, e dall’altra deve poter comunicare con l’ambiente acquoso interno o esterno. Questo implica che se la proteina viene purificata in acqua la parte lipofila viene destabilizzata, mentre se la purificazione avviene in un solvente organico è la parte idrofila a non essere più stabile. Questo può comportare una denaturazione della proteina, cioè un cambiamento di conformazione rispetto alla sua geometria abituale. Un esempio di denaturazione è quello dell’albumina contenuta nell’albume dell’uovo, che in seguito alla cottura da trasparente diventa bianca e opaca. Una proteina denaturata, per lo scopo che ci siamo prefissati, è del tutto inutile. Come abbiamo visto nel secondo paragrafo, la funzione di una proteina è direttamente correlata alla sua geometria tridimensionale: se dopo la purificazione la proteina ha una geometria diversa da quella originale allora tutti gli sforzi sono stati inutili! Per comprendere bene la difficoltà di questo compito basta considerare che la prima cristallizzazione di una proteina di membrana è avvenuta solo nel 1980 mentre la prima struttura tridimensionale è stata pubblicata nel 1985!

amphipoli bicelle nanodischi

Front. Pharmacol., 31 March 2015

Un primo punto critico è la scelta di un detergente appropriato. La proteina deve in qualche modo essere separata dalla membrana e questo si può fare con un sapone. Come abbiamo visto prima, i detergenti possono interagire con la porzione idrofobica di una molecola anfifilica come i fosfolipidi e di conseguenza destabilizzare la membrana. Scegliendo un detergente opportuno è possibile quindi liberare le proteine, portandole così in soluzione dove le molecole di detergente si aggregano per formare una specie di micella discoidale attorno alla porzione idrofobica. Le proteine così ottenute non possono però ancora essere studiate, in quanto i detergenti non permettono spesso alla proteina di assumere la sua conformazione abituale. È necessario “ricostruire” una simil-membrana, in modo che le proteine non si aggreghino tra di loro e non assumano conformazioni diverse da quelle originali. Un metodo può essere quello di utilizzare una classe di polimeri anfifilici detti Amphipols (APols). Questi si legano alla porzione trans-membrana della proteina (cioè la parte idrofoba della proteina che originariamente attraversava la membrana) e ne permettono il ripiegamento nella conformazione nativa stabile. Questo permette anche un effetto antiaggregante che può essere sfruttato per studiare la conformazione delle proteine con la risonanza magnetica, sebbene sia un metodo poco pratico per ottenere i cristalli necessari alla diffrazione a raggi X. Un secondo metodo ricorre a dei nanodischi, cioè delle membrane fosfolipidiche solubili delle dimensioni di qualche nanometro. Queste possono essere ottenute mescolando insieme dei fosfolipidi, dei detergenti e una classe di proteine chiamate MSP (membrane scaffold protein). Successivamente il detergente viene rimosso per dialisi e i nanodischi si auto-assemblano e si impilano gli uni sugli altri. All’interno di questi nanodischi le proteine ritrovano un ambiente molto simile a quello della membrana e in questa maniera sono stabilizzate nella loro conformazione originaria. Inoltre è possibile modificare la struttura di queste membrane artificiali in modo da potersi legare nel modo voluto ad una superficie, come il vetro o la mica, in modo che poi possano essere studiate anche con tecniche avanzate di microscopia come la microscopia a forza atomica (AFM). Per ottenere dei cristalli di proteine da poter utilizzare per la XRD, la tecnica più potente quando si vuole determinare la geometria tridimensionale di una molecola, è invece possibile utilizzare delle bicelle, cioè dei piccoli dischi formati da un doppio strato di alcuni tipi di lipidi e di molecole anfifiliche. Questa struttura a doppio strato è molto simile a quella della originaria rispetto a quella dei detergenti e permette di ottenere dei cristalli di qualità.

Lo studio quindi di queste nuove metodologie e il design di detergenti, polimeri, molecole anfifiliche e procedure sperimentali sempre più raffinate ha reso possibile ottenere delle strutture supramolecolari che si avvicinano sempre di più a quelle di una membrana cellulare. Ora però dobbiamo fare un passo avanti: è possibile far avvenire delle reazioni all’interno di queste strutture? È possibile mimare il funzionamento di organelli e vescicole? È possibile fare entrare e uscire dei nutrienti o dei farmaci? Quando è nata la vita la formazione di micelle e liposomi è stato sicuramente un passaggio fondamentale: ma la vita non è un sistema statico, ma uno in continua trasformazione!

 

Nanocamion e nanoreattori: costruiamo una nanoindustria

Una cellula assomiglia ad un industria sotto molti aspetti: quello che fa è ricevere dei materiali di partenza (nutrienti e ossigeno), trasformarli – in base ai bisogni del “mercato” – in un prodotto utile per l’organismo, esportarli e infine utilizzare il guadagno di tutta questa attività (cioè l’energia ricavata dal metabolismo) per replicarsi e sostenere le spese di “gestione”. Per il momento abbiamo visto come è possibile costruire il recinto della nostra nanoindustria: ora dobbiamo capire come far entrare e uscire i nanocamion che trasportano i materiali che ci servono e come costruire i nanoreattori che possono trasformarli.

Uno dei problemi principali legati alla farmacologia moderna è quello di creare dei farmaci intelligenti che possano andare ad agire solo dove servono davvero e non in tutto il corpo. Se nel caso di farmaci come l’aspirina o un analgesico questo problema è relativamente trascurabile, diventa un grosso svantaggio nel caso di farmaci molto aggressivi come quelli chemioterapici, che oltre al loro target – le cellule tumorali – spesso colpiscono anche le cellule sane. Quello che vorremmo è una specie di proiettile magico, una “bomba intelligente”.

Per ottenere lo scopo che ci siamo prefissati abbiamo bisogno di conoscere esattamente la biochimica del nostro bersaglio. Cosa lo rende diverso da tutto il resto del corpo? Cosa lo rende unico? Una volta che lo abbiamo capito possiamo progettare un sistema che sia attivo solo in quelle specifiche condizioni. Per farlo normalmente il farmaco viene racchiuso all’interno di un qualche tipo di trasportatore (un carrier), come un liposoma o una nanoparticella, che poi lo rilascerà nel sito d’azione. Mentre un liposoma, come abbiamo visto precedentemente, è formato da molecole tenute insieme solo da legami secondari dovuti dalla presenza di una parte idrofoba e una idrofila, nelle nanoparticelle il guscio è rigido ed è formato da legami primari. In pratica in una particella le molecole prima si auto-assemblano nella posizione corretta e poi si legano tra di loro tramite legami primari.

Possiamo avere due tipi di trasporto: uno passivo e uno selettivo. Nel trasporto passivo le particelle si accumulano in un posto piuttosto che in un altro non a causa di specifiche interazioni, ma semplicemente per la loro geometria, dimensione e altri fenomeni simili. In pratica è come se progettassimo dei camion che possono passare solo da alcuni cancelli, ma non da altri, a causa delle loro dimensioni. Come sfruttare, nella pratica, questi principi?

effetto EPR nei tessuti tumoraliI tessuti invasi dai tumori solidi sono molto diversi da tutti gli altri. Mentre un tessuto sano si è formato ed evoluto con calma, in maniera ordinata e organizzata, rispondendo a specifici bisogni e necessità, un tumore non è altro che una massa abnorme di cellule cresciute in maniera veloce, incontrollata, totalmente casuale e disorganizzata. All’interno di alcuni tumori crescono addirittura denti e capelli! Questa crescita così fuori controllo richiede molta energia e, quindi, molto sangue. Tuttavia i vasi sanguigni che nutrono il tumore sono, come tutto il resto, poco funzionali. Mentre i vasi sanguigni normali sono ricoperti da uno strato di cellule epiteliali coeso e impermeabile, quelli cancerosi sono danneggiati, sottili e permeabili, poiché le cellule non aderiscono bene tra di loro. A questo va aggiunto che nei tessuti tumorali è totalmente assente qualsiasi tipo di drenaggio dei prodotti di scarti da parte del sistema linfatico. A causa di queste due problematiche le nanoparticelle di diametro inferiore ai 400 nm (che, credetemi, è davvero tanto!) tendono ad accumularsi prevalentemente nei tessuti tumorali piuttosto che in quelli sani. Questo effetto si chiama EPR, Enhanced Permeability and Retention, ed è una delle prime caratteristiche dei tumori che ci viene in aiuto. Nonostante il trasporto passivo soffra comunque ancora di una selettività non elevata, già dal 1995 l’FDA ha approvato l’uso clinico del Doxil, un farmaco contenente dei liposomi che trasportano la doxorubicina.

Nel trasporto selettivo ho due possibilità di azione. La prima è modificare la superficie dei miei trasportatori in modo che contengano una molecola che si lega specificatamente a una certa proteina che viene espressa solo da un certo tipo di cellule, magari a quelle di uno specifico tumore. Questa via è complicata dal fatto che ogni tumore è completamente diverso, dal punto di vista biochimico, dall’altro. Inoltre la nostra conoscenza biologica non è ancora abbastanza approfondita da fornirci dei bersagli che siano veramente affidabili e unici di quel tipo di tumore. Per esempio è noto che molte cellule tumorali sono ricoperte da molti più recettori dell’acido folico rispetto le cellule sane. Questo permette di progettare delle nanoparticelle che possano interagire direttamente con questi recettori, ma oltre a una intrinseca difficoltà di sintesi c’è comunque un problema di selettività.

Una seconda via è quella di preparare dei carrier che possano rilasciare il loro carico solo in presenza di determinati stimoli, come temperatura e pH, tipici delle cellule tumorali. Quello che ci serve si chiama, in gergo tecnico, stimuli-responsive materials, materiale che risponde agli stimoli. Mentre le singole molecole sono in genere abbastanza restie al cambiamento, gli aggregati supramolecolari spesso sono invece molto dinamici e al cambiare delle condizioni possono cambiare geometria, possono sfaldarsi e ricomporsi. Quello che dobbiamo fare è quindi ricoprire il nostro farmaco con un guscio, un’armatura capace di impedirgli di reagire nelle condizioni sbagliate ma che invece poi lo rilasci quando è il momento giusto.

Abbiamo visto poco fa che i tumori solidi, per sostenere la loro crescita, hanno un disperato bisogno di ossigeno. Ma questa riproduzione incontrollata richiede molto più ossigeno di quello che può essere garantito da questi deboli vasi. Questo porta ad un ambiente anaerobio, cioè povero di ossigeno. In queste condizioni le cellule invece di sfruttare tutta la catena del metabolismo cellulare, che parte dalla glicolisi, continua con il ciclo di Krebs e termina con la respirazione cellulare, si limitano alla glicolisi, che non richiede ossigeno. Questo porta alla formazione di un prodotto di scarto, l’acido lattico, che si accumula e abbassa il pH. Ma oltre che nei tessuti tumorali esistono delle zone a pH diverso un po’ in tutto il corpo. Nello stomaco è compreso tra 1.5 e 3.5, è compreso tra 5 e 7 nel duodeno, nel colon e nel digiuno ed è 7.0 nell’ileo.

beta-ciclodestrinaCome rendere liposomi e nanoparticelle sensibili al pH? Una strategia consiste nell’aggiungere dei gruppi funzionali, come il gruppo amminico (-NH2) o quello carbossilico (-COOH). In ambiente acido il gruppo amminico si carica positivamente mentre il gruppo carbossilico di carica negativamente in ambiente basico. A pH intermedi avremo che solo una parte, via via più piccola, diventa carica. Dosando opportunamente la quantità di gruppo presenti è possibile ottenere dei sistemi che sono stabili ad un pH e non ad un altro, in quanto in condizioni le forze di repulsione elettrostatica possono portare alla disgregazione della struttura. Per esempio delle micelle basate su un polimero dell’amminoacido Istidina si destabilizzano a pH<7, portando al rilascio di un eventuale farmaco in esse contenuto. Un sistema interessante è formato invece da vescicole basate su un polimero contenete un’estremità che si carica in ambiente acido e una che si carica in ambiente basico. Dato che la presenza di cariche rende una molecola idrofila, a bassi pH questi polimersomi (liposomi composti da polimeri) hanno una estremità rivolta all’esterno e l’altra all’interno, quando il pH cambia la situazione si inverte e le molecole si capovolgono letteralmente! Ma una struttura ancora più spettacolare è formata da vescicole di β-ciclodestrina, un derivato degli zuccheri, e il derivato di un ottapeptide con l’adamantano (cioè una catena di otto amminoacidi a cui è stato legato anche dell’adamantano, una molecola organica lipofila). A pH basici questo sistema è stabile sotto forma di piccole sfere, ma quando il pH scende sotto cinque si formano invece delle fibre. Questo radicale cambio di geometria porta alla liberazione di un eventuale farmaco che era stato caricato nelle sfere a pH basico.

Sfruttando principi simili, cioè un attento design delle molecole coinvolte, la presenza di gruppi reattivi a determinate condizione, la riflessione sulle cariche e sulle interazioni idrofile-idrofobe, è stato possibile disegnare anche particelle che rispondono alla temperatura, che è normalmente più elevata nelle zone in cui è presente un’infiammazione, ma anche ai campi magnetici, agli ultrasuoni, alla luce, tutti stimoli che potrebbero permettere di rilasciare il farmaco dove desiderato. Inoltre il cambiamento della carica elettrica è molto importante anche per l’assorbimento delle particelle da parte delle cellule, dato che anche la membrana cellulare è molto sensibile alle cariche e permette il passaggio preferenzialmente di molecole neutre rispetto a quelle elettricamente cariche.

Ma è possibile anche sfruttare micelle, liposomi e vescicole per fare avvenire delle reazioni al loro interno, sfruttandole come nanoreattori e mimando così il comportamento di endosomi, mitocondri e altri organelli? La risposta ovviamente è sì, si può fare!

Come ormai sappiamo a memoria nelle micelle abbiamo un cuore interno idrofobo e una superficie esterna idrofila. Questo le rende ideali per far avvenire in acqua reazioni che normalmente dovrebbero avvenire in un solvente organico idrofobo. Molecole che normalmente in acqua sarebbero insolubili possono aggregarsi all’interno delle micelle formando delle “bolle” idrofobe molto concentrate, portando ad un aumento considerevole della velocità della reazione e della resa, cioè della quantità di prodotto ottenuto. Tutto questo rendendo inoltre il processo molto eco-friendly, dato che si riduce enormemente la quantità di solventi organici utilizzati, che sono costosi e altamente inquinanti. Un sistema ancora più ingegnoso è quello sviluppato da Van Hest sfruttando dei polimersomi caricati con tre differenti enzimi. In particolare nella parte interna, idrofila, è stato caricato un enzima che catalizza la trasformazione del glucosio acetato in glucosio, nella membrana lipofila è stato legato un enzima che permette l’ossidazione del glucosio in glucolattone e perossido di idrogeno, che a sua volta è stato poi ossidato da un terzo enzima. Indipendentemente dalle reazioni avvenute, che a prima vista possono non dire molto, quello che è stupefacente è che è stato ottenuto un sistema in cui ogni enzima era al suo posto, fisicamente distinto diverso da dove si trovavano gli altri, permettendo di far avvenire una reazione a cascata, cioè in cui ogni prodotto è il reagente della reazione successiva. Questo tipo di comportamento è fondamentale nei sistemi viventi, dove molti enzimi hanno una loro precisa localizzazione, essendo legati alla membrana cellulare, ai mitocondri, ai ribosomi e dove ogni processo metabolico è costituito da una sequenza di decine se non centinaia di reazioni.

scala evolutiva della vita su base molecolare

scala evolutiva della vita su base molecolare

 

Cosa manca ancora?

Grazie alla chimica supramolecolare (anzi, grazie solo ad alcuni degli infiniti risultati che ha ottenuto) siamo riusciti a mimare la formazione della membrane cellulare, a mimare il trasporto di nutrienti e farmaci dentro le cellule, a mimare la presenza di organelli e a far avvenire delle reazioni a cascata proprio come dovrebbero avvenire all’interno della cellula. Per fare tutto questo ci siamo basati quasi esclusivamente sull’auto-assemblaggio di molecole relativamente semplici, dimostrando così che processi simili sono potuti avvenire in passato anche naturalmente. Quello che manca è la vita. I nostri sistemi sono morti, non si riproducono, non trasmettono informazioni, non crescono. Cerchiamo di scalfire appena la complessità di ciò che è richiesto per produrre artificialmente un sistema capace di replicare sé stesso. Innanzi tutto, ci vuole un qualche surrogato del DNA. Questo in realtà già esiste: si chiama PNA, Peptide Nuclei Acid. Sono sequenze di amminoacidi a cui sono legati dei nucleotidi, portando ad una struttura molto simile a quella del DNA, tranne per il fatto che i filamenti invece di essere costituiti da nucleotidi e catene di zucchero-fosfato sono costituiti da nucleotidi e catene di amminoacidi. Purtroppo un DNA artificiale è assolutamente inutile, se non c’è qualcosa che possa leggerlo! Quindi immaginiamo di fare un passo indietro e continuare a usare un normale DNA e di rifornirlo con tutte le proteine necessarie per la sua replicazione. Immaginiamo anche di proteggerlo con una delle membrane artificiali che abbiamo visto più sopra. Ancora non ci siamo: il DNA magari può anche replicarsi, ma la membrana? Come fa a dividersi e a dare origine a due cellule figlie identiche? Ovviamente dobbiamo escludere di usare polimersomi o nanoparticelle, perché la loro struttura è troppo rigida. I liposomi sono già accettabili, in quanto non sono presenti legami covalenti tra le molecole di acidi grassi che li compongono. Dobbiamo procedere anche ad aggiungere periodicamente nuovi materiali di partenza per la sintesi di nuovi liposomi. Seguendo questa strategia, i gruppi di Szostak nel 2008 e di Sugawara nel 2009 sono riusciti a sintetizzare delle cellule artificiali in cui il DNA era capace di replicarsi grazie alla presenza di tutti gli enzimi e le molecole necessarie e, una volta che il nuovo DNA usciva dal suo liposoma, ne catalizzava la formazione di uno nuovo, a causa di una serie di interazioni elettrostatiche favorevoli e della presenza di precursori aggiunti dai ricercatori. La replicazione però va avanti per un paio di volte ma poi si blocca, in quanto queste “cellule” non sono capaci di duplicare anche gli enzimi per la replicazione e i precursori degli acidi grassi per la formazione di nuovi liposomi, che quindi a un certo punto finiscono o diventano troppo diluiti per permettere la continuazione della reazione. Molte associazioni pro-life forse non sarebbero d’accordo, ma se un sistema non può comunicare né interagire con l’esterno, non può muoversi, non può rispondere agli stimoli, non ha coscienza e per “vivere” ha bisogno di essere continuamente rifornito di energia e nutrienti con una siringa da una persona in camice, non è vivo.

 

Equilibrio

Un caratteristica fondamentale della vita è quella di essere sempre in uno stato lontano da quello di equilibrio. In chimica l’equilibrio è quello stato in cui la freccia del tempo si ferma: il sistema non evolve più né in un verso né nell’altro. Immaginiamo di versare due o tre grammi di sale grosso in un bicchiere d’acqua. Il sale all’inizio non si scioglie tutto, ma man mano che il tempo scorre la quantità di sale presente sul fondo diminuisce sempre più e la concentrazione di sale nell’acqua diminuirà dal fondo verso l’alto. Dopo una decina di minuti sarà tutto sciolto e il nostro bicchiere conterrà dell’acqua mediamente e uniformemente salata. Questo corrisponde al nostro stato di equilibrio. Una volta che tutto il sale si è sciolto e tutti i gradienti di concentrazione si sono annullati il sistema, in media, non cambierà più. È un equilibrio dinamico, nel senso che le particelle di sodio e di cloruro continuano a nuotare incessantemente e le molecole d’acqua vibrano, ruotano, si scontrano. Tutto il sistema brulica di movimento, ma è un movimento che in media non porta da nessuna parte. In media, il sistema è statico. Per un chimico studiare sistemi all’equilibrio è la normalità. Per un biologo, però, equilibrio vuol dire morte. Qualsiasi essere vivente si trova continuamente in uno stato lontano dall’equilibrio: interagisce con l’ambiente, si evolve, scambia energia, si nutre. È un incessante divenire. Ma tutto questo ha un prezzo, un prezzo energetico. La tendenza naturale di qualsiasi sistema, di tutto l’universo, è l’equilibrio. Per vincere questa aspirazione all’equilibrio è necessario che venga consumata dell’energia. Può essere cibo, come per gli animali, possono essere piccole molecole inorganiche, come per alcuni batteri, o può essere luce, come nelle piante.

Nei sistemi che abbiamo analizzato prima mancava qualcosa che permettesse al sistema di continuare a restare fuori dall’equilibrio. Vari studi in questo senso sono stati intrapresi, in particolare per creare delle cellule artificiali che possano sfruttare la luce solare o l’energia termica, ma purtroppo ancora senza successo. Riuscire a svelare il mistero della vita non è meramente un sogno utopico o una fantasia di scienziati perditempo. Pensate cosa vorrebbe dire riuscire a creare degli eritrociti artificiali, eliminando la continua corsa contro il tempo quando si tratta di trasfusioni di sangue. O avere la possibilità di creare dal nulla organi artificiali. Tutto questo non è mera curiosità, ma qualcosa che potrebbe cambiare la vita di tutti noi per sempre. Tuttavia richiede un cambio di prospettiva radicale.

 

Chimica, biologia, complessità

Quando scienziati provenienti da ambiti diversi, come fisici, chimici, biologi e matematici, si incontrano al bar, una delle battute più tipiche riguarda la presunta “scala di purezza” delle scienze. Secondo questa “scala di purezza”, la fisica non è che matematica applicata, la chimica è fisica applicata, la biologia è chimica applicata, la psicologia è biologia applicata e così via. Questa filosofia, detta “riduzionismo”, è molto più diffusa di quanto si pensi ed è stata una posizione dominante nel mondo accademico per molti anni. È il mondo-orologio di Cartesio, in cui ogni fenomeno può essere ricondotto a un qualche ingranaggio, a una legge di base che lo spieghi.

campi del sapere, in ordine di purezza

La realtà è che questo approccio è sbagliato. Come abbiamo detto in uno dei paragrafi iniziali, una casa è più di un insieme di mattoni e un essere umano è più di un insieme di molecole. C’è un momento in cui nella scienza entra in gioco la complessità. Un sistema complesso è formato da molte parti interagenti tra di loro e con l’ambiente, in cui ogni parte influenza l’altra, in cui gli stimoli esterni producono cambiamenti e portano ad una evoluzione del sistema. Da una parte diventa infatti difficile definire un rapporto diretto di causa-effetto – in quanto le variabili da controllare sono troppe e sono “intrecciate” tra di loro – e dall’altra spesso basta una differenza minima e impercettibile nelle condizioni iniziali per portare a risultati completamente diversi. È il classico esempio del battito d’ali di una farfalla in Brasile che provoca un tornado in Texas. Questo è quello che succede quando, in termini tecnici, il sistema smette di poter essere descritto da equazioni lineari ed è un comportamento tipico dei sistemi non all’equilibrio.

Man mano che aumenta la complessità di un sistema deve cambiare anche il linguaggio e l’approccio per descriverlo. È possibile tramite la teorie delle stringhe ricavare la meccanica quantistica. Attraverso la meccanica quantistica è possibile derivare il comportamento di una resistenza, di un condensatore o di un transistor. Dal comportamento di resistenze, condensatori e transistor è possibile spiegare il funzionamento di un computer. Ma non è possibile descrivere il software che sto utilizzando per scrivere questo testo con la teoria delle stringhe. Allo stesso modo un fisico non sarebbe mai capace di descrivere analiticamente tramite la meccanica quantistica il motivo per il quale una certa reazione chimica avviene in un certo modo e non in un altro. Al massimo potrebbe provare ad utilizzare il linguaggio della chimica, sfruttandone semplificazioni e approcci, per sviluppare un modello approssimato. Ma dovrebbe certamente rinunciare all’idea di trovare una qualche formula matematica che possa spiegare perché un certo chetone in una certa reazione ha una resa del 90% e un chetone appena leggermente diverso ha una resa del 73%.

Allo stesso modo il chimico deve fare un passo indietro quando si trova davanti la vita. Con la chimica possiamo spiegare molte cose, conosciamo ormai in dettaglio un enorme numero di trasformazioni estremamente complesse e ci sono volumi di migliaia di pagine dedicate solo alla replicazione del DNA. Ma non potremo mai, con i metodi della chimica, spiegare perché in un certo momento un nostro antenato comune ha deciso di scendere da un albero. Né potrà mai spiegare perché a un certo punto un qualche animaletto preistorico ha deciso casualmente di trasformarsi in un rinoceronte. Così come nessun biologo potrà mai spiegare, basandosi sulla biologia del neurobiologia, perché Hitler avesse un problema con gli ebrei e Schindler no.

La chimica supramolecolare in questo è una disciplina particolare, in quanto cerca di porsi in un certo senso a cavallo della chimica e della biologia, iniziando ad avvicinarci a un mondo in cui le molecole non sono particelle tutte uguali che reagiscono in maniera più o meno casuale all’interno di un solvente, ma entità capaci di aggregarsi, formare architetture capaci di reagire agli stimoli, di interagire con l’ambiente, di evolversi. In questo articolo ho volutamente sorvolato su molti aspetti della chimica supramolecolare importanti non meno di quelli riportati. Attraverso la chimica supramolecolare è stato possibile creare dei sensori estremamente sensibili per enzimi, proteine e piccole molecole, sensori che ci permettono di leggere la concentrazione di glucosio nel sangue in pochi secondi e utilizzandone una sola goccia. Questi sensori sono basati sul meccanismo di chiave-serratura che abbiamo visto per le proteine, un meccanismo di riconoscimento basato su interazioni reversibili e legami deboli. Altre applicazioni sono innumerevoli e si perdono anche in aree tradizionalmente molto lontane dalla chimica, come la computer science.

Ma la cosa più importante è che, da trent’anni, ha cambiato il modo in cui i chimici vedono il mondo.

ricerca immagini per supramolecular chemistry

Riferimenti

Per scrivere questo testo riferimenti indispensabili sono stati:
– B. Alberts, et al, Biologia Molecolare della Cellula, Zanichelli, Quinta Edizione (2015);
– D. A. Wilson et al, Mimicking the Cell: Bio-inspired Functions of Supramolecular Assemblies, Chem. Rev., pubblicato online il 19/11/2015;
– G. R. Desiraju, Chemistry Beyond the Molecules, Nature, 412, 397-400 (2001);
– J. M. Lehn, Toward complex matter: Supramolecular chemistry and self-organization, PNAS, 99, 4763-5768 (2002).

 

2 risposte a Oltre le molecole: chimica, vita, complessità

  • Tomas scrive:

    Bellissimo articolo..però non riesce a rispondere perché si è passati dalla non vita alla vita

    • Giuseppe Alonci scrive:

      Ciao Tomas. Il problema sta nel capire quando è che la non vita è diventata vita 🙂 È stato un processo graduale. Probabilmente prima alcuni nucleotidi hanno iniziato a formare i primi RNA. Questi RNA prima o poi hanno iniziato a essere circondati da una qualche specie di membrana, come una micella. Ma sono tutte ipotesi, noi lì non c’eravamo e ancora siamo ben lontani dal riuscire a riprodurre tutto questo in laboratorio!

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