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Dalla tecnologia del DNA ricombinante all’impiego degli enzimi di restrizione

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I percorsi storici che partono dalla scoperta  del DNA  e che arrivano alle nuove tecniche di sequenziamento o NGS  (parte I)

di Sergio Barocci

Nell’arco di circa 150 anni si è assistito a una vera e propria rivoluzione in campo biologico, che ha permesso di far luce su uno degli aspetti più affascinanti e misteriosi della vita cioè il patrimonio genetico degli organismi, dalla sua composizione alla sua struttura sino ad arrivare al suo funzionamento.

Miescher isola la nucleina dai leucociti del pusMiescher isola la nucleina dai leucociti del pusSe percorriamo le tappe storiche della scoperta del DNA diciamo che l’avventura ha inizio nel 1869 quando F. Meischner per la prima volta isola da globuli bianchi quella che chiama nucleina e che solo 50 anni dopo viene identificata chimicamente come DNA, arrivando, però, alla risoluzione della sua struttura soltanto nel 1953, da parte di J. D. Watson e F. Crick.
Da questo momento in poi diversi scienziati, spesso con ricerche portate avanti anche in collaborazione con altri di diversa nazionalità , che hanno fruttato in più occasioni il conseguimento di Premi Nobel per la Medicina e per la Chimica, sono riusciti a individuare:

  1. nel 1956 : il cariotipo umano è costituito da 23 coppie di cromosomi omologhi;
  2. nel 1958 : il meccanismo della duplicazione del DNA
  3. nel 1959 : la vera natura della sindrome di Down come anomalia cromosomica determinata dalla presenza di una triplice copia del cromosoma 21
  4. nel 1960 : l’enzima RNA polimerasi che sintetizza l’RNA secondo le istruzioni fornite da uno stampo di DNA
  5. nel 1961 : il ruolo dell’ RNA messaggero come traghettatore di informazioni dal DNA alle proteine nella sintesi proteica
  6. nel 1965 : la struttura di tRNA responsabile del trasporto dell’alanina nel lievito
  7. nel 1966 : la decifrazione del codice genetico che viene riconosciuto come universale.

allegoria delle modificazioni artificiali del DNASi passa poi a una fase successiva, nella quale vengono messe a punto le prime tecniche utili per le colture cellulari che consentiranno l’avvio dello sviluppo delle biotecnologie, a partire dalla scoperta nel 1968 degli enzimi di restrizione con i quali diventa possibile tagliare, isolare e introdurre un particolare gene nel DNA di un microrganismo, ottenendo il primo DNA ricombinante nel 1972.
E’ agli inizi degli anni ’70 che nasce infatti la tecnologia del DNA ricombinante, grazie al lavoro di Paul Berg che produce nel 1972 la prima molecola di DNA ricombinante utilizzando enzimi di restrizione e poi nel 1973 ai lavori di Herbert W. Boyer e Stanley Cohen che dimostrano

e usando per la prima volta un plasmide (i plasmidi sono molecole di DNA circolare a doppia elica che si trovano di norma in alcuni batteri ; sono di dimensioni variabili da due a parecchie centinaia di kilobasi o Kb e portano geni per l’inattivazione di antibiotici , per la produzione di tossine e per la degradazione di prodotti naturali).

Paul Berg

Paul Berg

Paul Berg (1926 – ) biochimico statunitense e professore emerito all’Università di Stanford U.S.A. Ha ricevuto il Premio Nobel per la Chimica nel 1980 insieme a Walter Gilbert e a Frederick Sanger per le loro ricerche sugli acidi nucleici.

stabilimento della Genentech

stabilimento della Genentech

Nel 1973, Boyer e Cohen dimostrarono che gli enzimi di restrizione avrebbero potuto essere utilizzati come “forbici” per tagliare frammenti di DNA di interesse da una fonte, per poi essere inseriti in un vettore – plasmide . Mentre Cohen proseguì i suoi studi ritornando nell’ambito del mondo accademico, Swanson venne contattato da Boyer per fondare la Genentech Inc . Boyer lavorò anche con il genetista Arthur Riggs e il chimico Keiichi Itakura della Beckman Research Institute, diventando i primi scienziati ad esprimere con successo un gene umano nei batteri producendo l’ormone somatostatina nel 1977. Al gruppo si sono poi aggiunti David Goeddel, Roberto Crea e Dennis Kleid che hanno contribuito alla produzione di insulina umana sintetica nel 1978. Nel 2009 la Genentech viene acquistata dalla Società farmaceutica svizzera Hoffmann – La Roche.

Stanley Cohen

Stanley Cohen

Stanley Cohen (1922 – ) biochimico statunitense, vincitore del Premio Nobel per la medicina nel 1986. Grazie alle sue ricerche sui fattori di crescita vinse il Premio Nobel per la medicina insieme a Rita Levi-Montalcini.

Herbert Boyer

Herbert Boyer

Herbert W. Boyer (1936 – ), biochimico statunitense che insieme all’imprenditore Robert A. Swanson ha fondato nel 1976 la Genentech Inc una società specializzata in attività biotecnologiche segnando un passo importante per l’evoluzione del settore della biotecnologia e nel campo della tecnologia del DNA ricombinante.

Questi cromosomi accessori si possono replicare indipendentemente dal cromosoma della cellula ospite e al contrario della cellula ospite non sono indispensabili in certe condizioni e una cellula batterica può non averne del tutto o ospitare fino a 20 copie dello stesso plasmide per clonare DNA ( uno dei più utili plasmidi per la clonazione è rappresentato dal pBR322 che contiene geni per la resistenza agli antibiotici tetraciclina e ampicillina) . In questo modo, si viene a costruire un DNA ricombinante contenente un gene di Xenopus laevis che è inserito nel batterio Escherichia coli consentendo la produzione di una proteina di rana in una cellula batterica . Si viene a creare un nuovo approccio all’esplorazione delle molecole fondamentali della vita che rivoluziona la biochimica fornendo mezzi molto potenti per costruire in laboratorio nuove molecole di DNA che possono poi essere clonate e amplificate introducendole in cellule adatte dove possono replicarsi utilizzando il corredo enzimatico della cellula ospite. Le molecole di DNA inserite vengono spesso espresse e tradotte nel nuovo ambiente. Pertanto, il patrimonio genetico dell’ospite viene ad essere alterato permanentemente in maniera preordinata.

 

LA TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE

struttura tridimensionale della trascrittasi inversa

struttura tridimensionale della trascrittasi inversa

La tecnologia del DNA ricombinante permette di creare e amplificare nuove molecole di DNA isolando e ricombinando fra loro frammenti di DNA di diversa origine. Tale tecnologia è il frutto di molti anni di ricerca di base sugli acidi nucleici e virus e si basa sulla disponibilità di enzimi di restrizione per mezzo dei quali diventa possibile tagliare il DNA in siti specifici, unire e replicare molecole di DNA di diversa origine e trascrivere l’RNA in DNA ad esempio mediante l’enzima trascrittasi inversa, scoperto da Howard Martin Temin e David Baltimore, che rappresenta la chiave per formare DNA complementare (cDNA).

I retrovirus utilizzano la trascrittasi inversa per formare un ibrido DNA-RNA nella replicazione del loro RNA genomico. L’enzima sintetizza un filamento di DNA complementare ad uno stampo di RNA se gli si fornisce un primer che si accoppia all’RNA e che contiene un gruppo 3’OH libero. E’ possibile utilizzare questo enzima per sintetizzare DNA da RNA messaggero ( mRNA) fornendo un primer di oligo(dT) che si accoppia con la sequenza di poli (A) presente al terminale 3’ della maggior parte delle molecole di mRNA degli eucarioti . Il resto del filamento di cDNA viene quindi sintetizzato in presenza dei quattro deossiribonucleotidi trifosfato.

Howard M. Temin

Howard M. Temin

Howard Martin Temin (1934 – 1994) virologo statunitense, vincitore del premio Nobel nel 1975 per i suoi studi sul virus del sarcoma di Rous, da lui individuato come il primo retrovirus. Nel 1970 riuscì ad isolare l’enzima in grado di sintetizzare DNA a partire dall’RNA virale , più noto come trascrittasi inversa.

David Baltimore

David Baltimore

David Baltimore (1938 -) biologo statunitense, vincitore del Premio Nobel per la medicina nel 1975 insieme a Renato Dulbecco e Howard Martin Temin , per le sue ricerche volte ad approfondire l’interazione tra i virus del cancro (oncovirus) ed il materiale genetico delle cellule.

Il filamento di RNA di questo ibrido RNA-DNA viene poi idrolizzato aumentando il pH . Il DNA al contrario dell’RNA è resistente all’idrolisi alcalina. Il terminale 3’ del filamento di DNA di nuova sintesi forma un ripiegamento a forcina che funziona da primer per la sintesi del secondo filamento di DNA. Questo ripiegamento viene poi rimosso mediante digestione ( nucleasi S1) che riconosce i nucleotidi non appaiati. A questo DNA a doppia elica si possono aggiungere tratti di DNA di unione sintetici per legarlo ad un vettore adatto. Le molecole di cDNA possono essere inserite in vettori (plasmidi) che ne favoriscono l’efficiente espressione in ospiti come l’Escherichia coli. I plasmidi o fagi vengono così chiamati vettori di espressione. In breve, la trascrittasi inversa possiede due attività:
a) attività di DNA polimerasi: in quanto questa proteina è in grado, usando sia una molecola di RNA o di DNA a singolo filamento come stampo, di sintetizzare la molecola di DNA corrispondente. Come tutte le polimerasi però richiede un frammento di DNA o di RNA come primer per poter iniziare la reazione di polimerizzazione;
b) attività di RNasi H: questa proteina riesce a degradare l’RNA dagli ibridi RNA-DNA formatisi durante la reazione di polimerizzazione così da poter formare un doppio filamento di DNA a partire da un singolo filamento di RNA).

 

ENZIMI DI RESTRIZIONE

Gli enzimi di restrizione chiamati anche endonucleasi di restrizione sono enzimi che creano tagli a doppio filamento sul DNA. Le particolarità che distinguono gli enzimi di restrizione dalle endonucleasi classiche è il fatto che contengono anche un’attività metiltransferasica con la quale metilano il DNA endogeno sui siti di taglio, impedendo agli stessi enzimi di riconoscerli.

attacco di batteriofagi su di una cellula batterica

attacco di batteriofagi su di una cellula batterica

I siti di taglio su DNA esogeno saranno dunque non metilati e riconosciuti dall’enzima, che opererà il taglio distruggendo il DNA. Questo è un meccanismo di difesa molto usato dai batteri per esempio, per difendersi dai batteriofagi che introducono il loro materiale genetico nella cellula ospite. Inoltre le endonucleasi di restrizione possono operare tagli sfalsati, creando estremità non piatte (esistono tuttavia anche enzimi di restrizione che operano tagli piatti).

I siti di riconoscimento delle endonucleasi di restrizione sono in genere sequenze composte da 4 o 6 nucleotidi che formano sequenze palindrome, ovvero che si leggono allo stesso modo da una parte o dall’altra (rispetto al filamento) es. GAATTC per EcoR1.

Possono esistere anche sequenze di taglio più lunghe ma la frequenza delle sequenze nel genoma è inversamente proporzionale alla lunghezza della sequenza stessa. La differenza tra le endonucleasi di tipo II e quelle di tipo I è che in quelle di tipo II la sequenza di riconoscimento e di taglio coincidono , ed inoltre l’attività metiltransferasica e quella endonucleasica sono separate.

interazioni molecolari tra vari tipi di endonucleasi di restrizione e catene di DNA

interazioni molecolari tra vari tipi di endonucleasi di restrizione e catene di DNA

Grazie a ciò le endonucleasi di tipo II sono ampiamente usate in biologia molecolare per creare vettori che contengano DNA esogeno semplicemente digerendo i due filamenti di DNA da ibridare, contenenti la sequenza di taglio, con un appropriato enzima di restrizione. La separazione delle due attività nelle endonucleasi di restrizione di tipo 2 permette inoltre di utilizzare la sola attività endonucleasica e riutilizzare i siti di restrizione per usi futuri.

La disponibilità di molti tipi di enzimi di restrizione e di DNA ligasi , enzimi che invece uniscono frammenti di DNA, rende possibile trattare sequenze di DNA come moduli e spostarli a piacimento da una molecola all’altra. Di importanza fondamentale nella tecnologia del DNA ricombinante è l’accoppiamento tra le basi per costruire nuove combinazioni di DNA oltre che per identificare sequenze particolari. Questa tecnologia dipende anche dall’esistenza dei virus e dalla conoscenza dettagliata dei loro rapporti con gli ospiti suscettibili di infezioni. Infatti, i virus introducono il loro DNA o RNA nelle cellule obbligandole a replicare il genoma virale, a produrre proteine virali o a incorporare DNA virale nel loro genoma. Anche i plasmidi sono risultati indispensabili nella tecnologia del DNA ricombinante.

Gli enzimi di restrizione sono pure risultati indispensabili per analizzare la struttura dei cromosomi , per sequenziale molecole lunghe di DNA , per isolare i geni e per creare nuove molecole di DNA che si possono clonare. Gli enzimi di restrizione sono stati scoperti alla fine degli anni ’60 da Hamilton Smith, Werner Arber e Daniel Nathans.

Hamilton O. Smith

Hamilton O. Smith

Hamilton Othanel Smith (1931 – ) biologo statunitense, vincitore del Premio Nobel per la Medicina nel 1978 per la scoperta degli enzimi di restrizione di tipo II, insieme a Werner Arber e Daniel Nathans. Smith è poi diventato una figura di spicco nel nascente campo della genomica, quando nel 1995 insieme ad un team dell’ Institute for Genomic Research ha sequenziato il primo genoma di un batterio, Haemophilus influenzae. Questo era lo stesso organismo nel quale Smith aveva scoperto gli enzimi di restrizione alla fine degli anni ’60. . Successivamente ha avuto un ruolo chiave nel sequenziamento di molti dei primi genomi trattati all’Institute for Genomic Research, e nel sequenziamento del genoma umano alla Celera Genomics, alla quale si è affiliato fin dalla fondazione nel 1998.

Gli enzimi di restrizione si trovano in molte cellule procariotiche dove svolgono il ruolo di spezzare molecole di DNA estraneo. Il DNA proprio della cellula non viene attaccato perché i siti riconosciuti dai suoi enzimi di restrizione sono metilati ( la metilazione è un sistema di protezione chimico; si attaccano gruppi metilici – CH3 ad alcune basi del proprio DNA, che disattivano l’azione enzimatica). La maggior parte di questi enzimi riconoscono sequenze specifiche di lunghezza compresa fra 4 e 8 basi e idrolizzano un legame fosfodiestereo su ciascun filamento in questa regione. Una caratteristica notevole della maggior parte di questi siti di taglio è la loro simmetria rotazionale cioè la sequenza riconosciuta è palindromica e i siti di taglio sono a livello dell’asse di simmetria.

sede della Celera Genomics

sede della Celera Genomics

Sono stati purificati e caratterizzati molti enzimi di restrizione. I loro nomi sono costruiti da una abbreviazione a tre lettere che sta ad indicare l’organismo di appartenenza (per es. Eco sta per Escherichia coli , Hin sta per Hemophilus influenzae, Hae per H. aegyptius) seguito dall’indicazione del ceppo e da un numero romano ( se l’organismo produce più di un enzima di restrizione)
EcoRI HpaI HindIII.

modalità di azione di enzimi di restrizione sulle catene di DNA

modalità di azione di enzimi di restrizione sulle catene di DNA

Essi vengono utilizzati per tagliare le molecole di DNA in frammenti specifici che possono essere analizzati e manipolati . Per es. il DNA a doppia elica circolare di 5,1 Kb ( Kb = Kilobasi cioè unità di lunghezza uguale a 1000 coppie di basi o bp di una molecola di acido nucleico a doppio filamento o a 1000 basi di una molecola a filamento singolo) di un virus tumorale come SV40 viene tagliato in un punto dall’EcoRI , in quattro punti da un altro enzima di restrizione come HpaI e ancora in undici punti dall’HindIII. Pertanto, un pezzo di DNA prodotto dall’azione di un enzima di restrizione può essere tagliato specificamente in pezzi più piccoli da un altro enzima di restrizione.

frammenti di DNA "digerito" separati e visualizzati mediante elettroforesi su gel

frammenti di DNA “digerito” separati e visualizzati mediante elettroforesi su gel

Il profilo della separazione di questi frammenti può servire da fingerprinting (immagine specifica di riconoscimento) di una molecola di DNA. Il taglio sulla doppia elica del DNA può essere simmetrico o sfalsato, generando tipi diversi di estremità, piatte oppure sporgenti.
I frammenti di restrizione si possono separare e visualizzare mediante gel elettroforesi.

 

 

Una risposta a Dalla tecnologia del DNA ricombinante all’impiego degli enzimi di restrizione

  • chiara scrive:

    Mi spieghereste come la tecnologia del dna ricombinante eé applicata ai vaccini,é corretto dire che il ricevente del vaccino avrà una modifica del proprio dna dovuto alla presenza del virus che contiene parti del dna umano da cui é stato prodotto in laboratorio?grazie

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