il Progetto Genoma Umano

di Sergio Barocci

logo di Human Genome Project

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Se abbiamo ora a disposizione la mappa completa del genoma umano cioè l’intero DNA della nostra specie trasformato in un contenuto digitale di 1,5 Gigabyte, reperibile su Internet (Road Map Epigenomics) e che tutti i ricercatori, usano ed elaborano per i loro scopi, lo dobbiamo esclusivamente al Progetto Genoma Umano o HGP, una delle imprese scientifiche più importanti della storia dell’umanità per ambizione e risorse impiegate. Il coronamento di decenni di ricerca biologica da cui ha preso inizio una nuova era, l’era “post-genomica”.
L’idea di fondo del Progetto è stata l’acquisizione di conoscenze che fossero di fondamentale importanza per la comprensione dei meccanismi della genetica umana e per l’implicazione dei geni nello sviluppo delle malattie umane ma soprattutto per l’identificazione e per la mappatura di tutti quei geni presenti nel genoma umano e per il loro posizionamento, almeno approssimativamente sui cromosomi, allo scopo di sviluppare metodi più efficienti e veloci di sequenziamento del DNA, di mettere a punto software per gestire, assemblare e analizzare l’immensa mole dei dati di sequenza prodotti e infine di considerare gli aspetti etici, sociali e legali legati dalla disponibilità di dati così delicati relativi alle persone.

Ma perché sequenziare l’intero genoma umano?

copertina di Scienze dedicata al Progetto Genoma UmanoPerché la conoscenza dell’intero genoma umano conduce a possedere tutte le pagine del manuale necessario per costruire il corpo umano. Ma la cosa importante è come leggere il contenuto di queste pagine e comprendere come le singole parti funzionano e interagiscano. Tutto questo vuole dire cercare di identificare i geni che controllano i vari passaggi di ciascuna via metabolica e di scoprire quali variazioni sono associate a patologie o predispongono a malattie.
Quindi, avere a disposizione l’intera sequenza del genoma permette di sviluppare metodi diagnostici efficaci con la finalità di inquadrare meglio le necessità sanitarie delle persone, basandosi sulla composizione genica dell’individuo permettendo lo sviluppo di nuovo farmaci più efficaci e mirati.

La nascita del Progetto Genoma Umano

A partire dagli anni’70 due nuove tecnologie cambiarono radicalmente il campo della ricerca biologica, consentendo la lettura del genoma di ogni organismo vivente. La prima di queste tecnologie fu il clonaggio del DNA che ha permesso di preparare le genoteche di DNA (collezione completa di frammenti di DNA, inseriti singolarmente in un vettore di clonaggio che può essere un plasmide, un cosmide o un fago ; possono essere di DNA genomico o di cDNA); la seconda , invece, fu rappresentata dall’invenzione dei metodi di sequenziamento del DNA ( il metodo di taglio chimico sviluppato da Allan Maxam e Walter Gilbert e il metodo enzimatico di Sanger) per stabilire con precisione come sono disposte una dopo l’altra le quattro basi azotate A = adenina, G= guanina,C=citosina,T= timina in lunghissime sequenze milioni o miliardi di basi.
Quindi, il Progetto Genoma Umano ha rappresentato, in sostanza, l’anello di congiunzione fra la ricerca genetica e la ricerca genomica
Tale Progetto o HGP (Human Genome Project) ebbe le sue origini ideologiche già a partire dai primi anni ’80 quando i due più importanti laboratori per lo sviluppo della genetica umana in relazione allo sviluppo delle armi nucleari rispettivamente a Los Alamos (Nuovo Messico) e a Livermore (California) incominciarono a lavorare al progetto Biblioteca Genetica.

Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti d'America o DOE

Dipartimento dell’Energia degli Stati Uniti d’America o DOE

In particolare, tale progetto iniziò a prendere la sua vera forma grazie ai precedenti anni di lavoro finanziati dal Dipartimento dell’Energia degli Stati Uniti d’America (DOE) interessato, a quel tempo, alla valutazione degli effetti provocati dalle mutazioni nell’ambito di programmi nucleari civili e militari e poi dopo un workshop, nel mese di dicembre del 1984 ad Alta nello Stato dello Utah, organizzato dallo stesso Dipartimento per valutare l’efficacia delle tecnologie utilizzate all’identificazione di mutazioni Tuttavia, la possibilità di decodificare il genoma umano per intero, per la prima volta, fu presa in considerazione nel maggio del 1985 da un certo Robert Sinsheimer dell’Università della California di Santa Cruz durante un convegno da lui stesso organizzato, mentre nel mese di dicembre dello stesso anno Kary Mullis alla Cetus Corporation sviluppava la tecnica dell’amplificazione a catena polimerasica o PCR (Polymerase Chain Reaction) una tecnica per replicare vaste quantità di DNA , che ben presto rivoluzionerà il modo di fare biologia molecolare.
Nel febbraio del 1986 Sidney Brenner del Medical Research Council, Cambridge, U.K. propose all’Unione Europea di mettere a punto un programma che riguardava la mappatura e il sequenziamento dell’intero genoma Ma l’importanza e la fattibilità di questo progetto furono ribadite nel marzo del 1986 a Santa Fè nel Nuovo Messico in un meeting organizzato dal Ministero dell’ Energia degli Stati Uniti .

Sydney Brenner e Renato Dulbecco

Sydney Brenner (a sinistra) e Renato Dulbecco (a destra)

Sydney Brenner (1927 – ) biologo sudafricano e premio Nobel per la medicina per gli studi compiuti insieme a H. Robert Horvitz e John E. Sulston sulla regolazione genica cellulare e sull’apoptosi.

Renato Dulbecco (1914 – 2012) è stato un biologo e medico italiano, insignito del premio Nobel per la medicina nel 1975.

Nel mese di giugno gli aspetti salienti del Progetto Genoma Umano furono caldamente dibattuti al Congresso “The Molecular Biology of Homo Sapiens” tenutosi al Cold Spring Harbor Laboratory nello stato di New York e nello stesso mese giunse l’annuncio da parte di Leroy Hood e di Lloyd Smith del California Institute of Technology (Caltech , Pasadena) della creazione della prima macchina automatica per il sequenziamento del DNA .

Nello stesso periodo di tempo, Renato Dulbecco del Salk Institute di La Jolla California, vincitore nel 1975 del premio Nobel per la fisiologia o medicina, espose in un editoriale pubblicato dalla rivista «Science» l’idea di mappare il DNA umano per poter sconfiggere il cancro e per capire alcuni dei fenomeni biologici che lo coinvolgevano.
Si arrivò così all’anno 1987 dove nel mese di aprile la DOE pubblicò un documento nel quale furono individuate alcune iniziative sul genoma umano che dovevano essere potenziate :
a) la realizzazione di mappe fisiche dei cromosomi umani a diverse risoluzioni,
b) lo sviluppo di tecnologie di supporto per la ricerca sul genoma umano,
c) il potenziamento della divulgazione delle informazioni e in particolare la realizzazione di un apposito software di database.
Agli inizi del Progetto genoma umano, le librerie di DNA genomico disponibili contenevano inserti lunghi fino a 40 kb, i cloni cosmidici. Una libreria di questo tipo con inserti di tali dimensioni avrebbe dovuto essere costituita da diverse centinaia di migliaia di cloni differenti affinché il 100% del genoma umano fosse rappresentato nella libreria.

Ecco che, per ridurre il numero dei cloni, nel maggio del 1987, David Burke, Maynard Olsen e George Carle svilupparono alla Washington University di S. Louis – Missouri dei nuovi metodi che utilizzavano dei vettori impiegati nella tecnologia del DNA ricombinante, i cosiddetti cromosomi artificiali di lievito o YACs (Yeast Artificial Chromosomes). Combinando piccole sequenze derivate da questi cromosomi di lievito con grossi frammenti di DNA umano fu possibile produrre molecole ibride contenenti inserti umani lunghi anche alcune megabasi (Mb), ma che nelle cellule di lievito si comportavano ancora come cromosomi.

Vettore YAC

Vettore YAC (Yeast Artificial Chromosome), cioè un cromosoma artificiale di lievito (organismo eucariote) in cui viene inserito un grande inserto di DNA da 100 Kb sino a 3000 Kb da sequenziare

Questo processo consentì un loro uso, inizialmente intensivo, negli studi sui genomi degli eucarioti superiori ma che poi quando si scoprì che il DNA clonato nei vettori YAC poteva essere costituito da DNA proveniente da posizioni diverse del genoma, il Progetto Genoma Umano iniziò a muoversi verso altre direzioni: la creazione di mappe geniche cioè di trascritti ad alta risoluzione e l’utilizzo di mappe di siti STSs (sequence tagged sites) impiegando cloni di nuova generazione ottenuti non più da YAC ma da altri tipi di vettori artificiali di DNA come i cromosomi batterici artificiali o BAC (bacterial artficial chromosome) basati sul plasmide F isolato da Escherichia coli, i quali, nonostante i loro inserti fossero più piccoli della lunghezza di 100-200 kb , rimediavano alle problematiche di stabilità e di affidabilità riscontrate con i cloni YAC . Da questo momento come stampi fisici per il sequenziamento venne utilizzata una varietà di librerie diverse di BAC umani
Dipartimento dell’Energia degli Stati Uniti d’America o DOE.

California Institute of Technology o Caltech

California Institute of Technology o Caltech

Ad Ottobre del 1987 Helen Denis Keller e il suo gruppo di ricerca produssero la prima mappa genetica dell’intero genoma umano mentre altri scienziati di un’azienda chimica la Du Pont fondata a Wilmington nello stato del Delaware svilupparono, invece, un sistema per il sequenziamento rapido del DNA con dideossinucleotidi marcati con fluorocromi diversi (ddNTPs) a terminazione di catena. In tal modo, anziché quattro reazioni distinte per ogni nucleotide modificato, si fornì la possibilità di effettuare una sola reazione utilizzando i quattro ddNTPs marcati con fluorocromi in modo diverso tra loro con l’uso di lettori ottici appropriati (ogni filamento di DNA fu così in grado di emettere una luce di colore diverso in base al nucleotide (ddNTP) col quale terminava).

sequenziatore automatico di DNA

Il sequenziatore automatico di DNA dell’Applied Biosystems (ABI 373 A) che marcava con coloranti fluorescenti i nucleotidi del DNA, che divenivano così leggibili attraverso uno scanner laser.

Basandosi su questa procedura, la società Applied Biosystems nel 1987 mise in commercio la prima macchina a sequenziamento automatico ad alta velocità del DNA basata sulla tecnologia sviluppata da L. Hood, successivamente impiegata per il Progetto Genoma Umano. Con questa procedura completamente automatizzata, si ottenne un grosso risparmio in termini tempo, potendosi così identificare 12.000 paia di basi al giorno.

Nel febbraio del 1988 il National Research Council statunitense (NRC) approvò il Progetto Genoma con durata di 15 anni e nel frattempo James Wyngaarden, direttore del National Institute of Health (NIH), ad un Congresso organizzato nella città di Reston nello stato della Virginia, rimarcò la necessità che la gestione del Progetto Genoma doveva essere affidata allo stesso NIH, il quale qualche mese dopo istituì un Organo competente per questa materia all’interno della sua organizzazione e precisamente un Ufficio per la Ricerca del Genoma Umano, rinominato poi come “National Center for Human Genome Research
In seguito a questi eventi, nell’ ottobre del 1988 l’ NIH e il DOE costruirono un Comitato congiunto stanziando i fondi necessari e formalizzando la loro collaborazione con un documento in cui si proposero di coordinare la ricerca e le procedure tecniche per lo studio del genoma.
Nel 1989 incominciarono a svilupparsi nuove tecnologie per il sequenziamento automatico che impiegavano sistemi per la rilevazione della fluorescenza. L’introduzione della marcatura fluorescente permise, in tal modo, il passaggio dal sequenziamento manuale a quello automatico con corsa elettroforetica su gel di poliacrilamide, su supporto a lastra o a capillare. In entrambi i casi la migrazione dei vari frammenti fu seguita rilevando le emissioni in fluorescenza a diverse lunghezze d’onda dei diversi fluorocromi dopo eccitazione provocata dal laser.
Le emissioni furono raccolte e analizzate da una camera CCD (charge coupled device) che elaborava i diversi segnali di fluorescenza con elevata sensibilità e la sequenza delle bande di DNA marcato fu così visualizzata in un unico grafico, detto elettroferogramma, caratterizzato da una successione di picchi di quattro colori diversi, che corrispondevano alle emissioni fluorescenti dei diversi fluorocromi, ogni volta che i vari frammenti di diversa lunghezza nucleotidica raggiungevano, lungo la corsa elettroforetica, la posizione del rilevatore.

esempio di elettroferogramma

esempio di elettroferogramma

Nel gennaio del 1989 la prima riunione del Comitato per il programma HGP fu gestita da Norton Zinder della Rockfeller University a New York (famoso per aver scoperto la trasduzione genetica cioè quel meccanismo che consente il trasferimento virale di DNA da un batterio ad un altro e nel mese di settembre M. Olson, L. Hood e D. Botstein insieme a C. Cantor pubblicarono, invece, sulla Rivista Science una nuova strategia di mappatura attraverso brevi tratti di DNA, lunghi da 100 sino a 500 paia di basi o bp distribuiti su tutta una regione genomica o su tutto il genoma, chiamati STSs (sequence tagged sites) rilevabili facilmente con la reazione di PCR con specifici primer per la costruzione di mappe genetiche e fisiche da dati di sequenza.

Gli STSs saranno in seguito anche utilizzati nel sequenziamento detto “shotgun” ( un metodo di sequenziamento utilizzato per sequenziare lunghi tratti di filamenti di DNA ), in particolare per facilitare l’allineamento di più sequenze di DNA per la ricostruzione della sequenza originale.
L’avvio delle ricerche iniziò nel 1990 quando venne pubblicato un piano quinquennale degli istituti coinvolti ; tra gli obiettivi, indicati ci furono :
– il sequenziamento e la mappatura di organismi comunemente impiegati nei laboratori di ricerca genetica (quali il batterio Escherichia coli, il lievito Saccharomyces cerevisiae e il moscerino della frutta Drosophila melanogaster), e della specie umana;
– la diffusione dei dati tra i vari centri;
– lo sviluppo delle tecnologie di laboratorio
Ciò fu reso possibile, dopo che negli anni ’80 vennero affinate sia :
a) la tecnica di F. Sanger sviluppata nel 1977 e ampiamente utilizzata in quegli anni, passando dai quattro ddNTPs marcati con radioattivi ai quattro ddNTPs marcati con fluorocromi in modo diverso tra loro utilizzando lettori ottici appropriati in modo che ogni filamento di DNA era in grado di emettere una luce di colore diverso in base al nucleotide (ddNTP) col quale terminava,

b) la messa a punto di un metodo di sequenziamento chiamato “shotgun” che utilizzava due strategie, reciprocamente complementari per la frammentazione e la ricostruzione delle sequenze di centinaia di migliaia di frammenti di DNA, A) il sequenziamento gerarchico o top down (clone by clone) B) il sequenziamento su larga scala o bottom – up (whole genome shotgun)

hierarchical shotgun sequencing

Hierarchical shotgun sequencing (clone by clone) : un singolo cromosoma viene spezzettato in larghi frammenti e poi clonati in vettori artificiali (BAC o YAC) . I cloni vengono ordinati in contigs e ciascuno ulteriormente suddiviso in altri cloni ordinati. Quando i cloni raggiungono dimensioni appropriate vengono successivamente sequenziati. Ogni clone si sottopone a fingerprinting (pattern di restrizione o STSs) e il risultato è una mappa fisica di cloni ordinati e delle loro rispettive sequenze . La sequenza finale viene ottenuta allineando le sequenze dei singoli cloni

shotgun genome sequencing

Whole genome shogun sequencing : il DNA viene spezzettato in maniera random in numerosi piccoli frammenti di dimensioni sequenziabili. Tali sequenze vengono denominate reads (piccole sequenze di DNA di sintesi ottenibili da una reazione di sequenziamento) .Le reads vengono poi assemblate come in un puzzle sfruttando le regioni di sovrapposizione alle estremità di ciascuna read. Dall’allineamento delle reads si ottengono sequenza più lunghe dette contig o contigue ( tratti di sequenza assemblata senza discontinuità) che a loro volta vengono riuniti in sequenze di dimensioni maggiori dette scaffold le cui estremità sono in diversi contig ma di cui non si conosce la regione centrale. Questi scaffolds vengono ulteriormente allineati fino a costruire un assemblato finale o assembly. L’assembly genomico non rappresenta altro che un genoma completo.

Nello stesso anno tre gruppi di ricercatori Lloyd Smith del Nucleic Acid Research, Barry Karger dell’Analytical Chemisty e Norman Dovichi del Journal of Chromatography svilupparono l’elettroforesi capillare per la separazione di frammenti marcati con fluorocromi in sistemi automatizzati per la rilevazione della fluorescenza, consentendo un notevole aumento della processività della tecnica. L’elettroforesi avveniva lungo dei sottilissimi capillari del diametro di 50 nm contenenti al loro interno un polimero da corsa, automaticamente caricato dal sistema. Lo strumento dopo aver prelevato il prodotto della reazione di marcatura con i fluorocromi sottoponeva la reazione stessa ad elettroforesi capillare in vetroresina di diversa lunghezza d’onda a seconda delle esigenze. Un raggio laser, a questo punto, colpiva il capillare eccitando i fluorocromi marcanti i frammenti di diversa lunghezza. Successivamente una cellula fotoelettrica rilevava e memorizzava i segnali fluorescenti.
La quasi totalità delle sequenze disponibili nelle banche dati sino a quel periodo di tempo furono ottenute attraverso il sequenziamento enzimatico di Sanger. Successivamente si svilupparono modelli di sequenziatori automatici in grado di eseguire anche corse elettroforetiche multiple su apparecchi multicapillari.

elettroforesi capillare su gel per separare frammenti di DNA

elettroforesi capillare su gel per separare frammenti di DNA

Nel mese di aprile il NIH e il DOE pubblicarono un piano di 15 anni i cui obiettivi compresero una mappa genetica completa, una mappa fisica con marcatori ogni 100 Kb e il sequenziamento di un aggregato di DNA di 20 Mb in organismi modello entro l’anno 2005. Nel mese di agosto l’NIH iniziò lo studio del sequenziamento su larga scala di quattro organismi modello rappresentati da Escherichia coli, Mycoplasma capricolum, Caenorhabditis elegans e Saccharomyces cerevisiae mentre nel mese di ottobre NIH e DOE dichiararono ufficialmente l’inizio del Progetto Genoma Umano della durata di circa 15 anni e un costo di 15 miliardi di dollari, sotto la guida di James Watson, lo scienziato che elaborò nel 1953 lo storico modello del DNA a doppia elica con Francis Crick (entrambi Premi Nobel per la medicina nel 1962)
Negli anni successivi al Progetto Genoma si unirono anche i ricercatori appartenenti al Regno Unito, Giappone, Francia, Germania e Cina costituendo con gli Stati Uniti il Consorzio Pubblico Internazionale (IHGSC, International Human Genome Sequencing Consortium).
Per l’Italia il progetto genoma nacque nel 1987 ma si interruppe nel 1995 per mancanza di fondi.
Nello mese di ottobre David Lipman e Eugene Myers pubblicarono sulla rivista Journal of Molecular Biology la creazione dell’algoritmo BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) un programma informatico che sarà utilizzato per l’allineamento delle sequenze di DNA.
Il l Progetto Genoma Umano incominciò ad avere un’ingente mole di finanziamenti dell’ordine di alcuni miliardi di dollari e catturò anche l’attenzione dell’opinione pubblica specialmente per la presenza di figure di notevole spicco scientifico che si erano adoperati alla sua realizzazione anche se a dire il vero la sua storia risulterà spesso molto travagliata.
copertina della rivista Nature dedicata alla mappatura genetica del topoNel 1991 il Progetto genoma umano, iniziò cosi a funzionare a pieno ritmo. Tutti i centri del NIH furono subito operativi incominciando ad occuparsi della mappatura genetica umana (Homo sapiens) e del topo (Mus musculus). La mappatura genetica e le attività di sequenziamento furono realizzate anche da decine di altri laboratori, ognuno dei quali svolse attività iniziate autonomamente e finanziate dai NIH.
I dati relativi al genoma ottenuti sulle due sponde dell’Atlantico furono immagazzinati in alcuni data base centralizzati, inclusi quelli del Laboratorio Europeo di Biologia Molecolare, del National Laboratory di Los Alamos e del Centro di Ricerche sul Genoma dei NIH a Washington. Tutti gli enti coinvolti in tale progetto concordarono sul principio base secondo il quale la Comunità Scientifica Mondiale poteva accedere gratuitamente ai dati raccolti. Tuttavia, il Progetto Genoma Umano forse non si sarebbe mai potuto completare se un biologo statunitense del NIH, John Craig Venter (1946-), non avesse sollevato una serie di questioni che riguardavano questo principio. Infatti, nel 1987 il suo laboratorio operava come centro di verifica delle nuove tecniche di sequenziamento automatico (il sequenziatore automatico di DNA che marcava con coloranti fluorescenti i nucleotidi leggibili attraverso uno scanner laser e identificando così circa 12.000 paia di basi al giorno) sviluppate presso il California Institute of Technology e prodotte dalla Applied Biosystems.

John Craig Venter

John Craig Venter

Nel giugno del 1991, J. C. Venter annunciò una strategia per individuare i geni espressi , utilizzando dei brevi frammenti di circa 200–800 bp chiamati EST (Expressed Sequence Tag) che derivavano dal sequenziamento di una parte di un maturo RNA messaggero proveniente da cloni di cDNA o DNA complementare. Le EST potevano essere utilizzate per stabilire l’estensione e la diversità dei geni e il grado di trascrizione di ciascuno di essi.
In questo modo Venter fu in grado di produrre notevoli quantità di EST così rapidamente e un mese più tardi in occasione di una audizione congressuale lo stesso Venter rivelò che l’NIH si era impossessata del brevetto su un migliaio di EST. Tale iniziativa venne denunciata in Europa e negli Stati Uniti, perché rischiava di porre seri ostacoli alla ricerca. Nonostante tutte queste controversie, il Progetto Genoma Umano in quel periodo burrascoso andò avanti ugualmente. Vennero, infatti, messi a punto dei programmi elaborati, per affiancare all’identificazione di sequenze potenzialmente codificanti, anche altre caratteristiche, come ad esempio la presenza di giunzioni tra esoni (le regioni del trascritto primario che si ritrovano nel trascritto maturo) e introni (le parti rimosse nel corso della maturazione e di norma non contenenti regioni codificanti).
Altre caratteristiche utilizzate furono il riconoscimento di strutture tipiche dell’inizio e della fine della catena polipeptidica o dell’RNA, come pure sequenze normalmente presenti nelle regioni contenenti promotori, gli elementi funzionali necessari all’espressione di un gene. Così , nel dicembre del 1991 nacque il primo di molti programmi denominato “GRAIL” (Gene Recognition and Assembly Internet Link), sviluppato all’Oak Ridge National Laboratory nel Tennessee, il primo di molti programmi. Il programma GRAIL fu aggiornato più volte per aggiungere caratteristiche che non erano presenti nella versione originale e in grado, oggi, di riconoscere promotori, esoni, siti di aggiunta di poli-A, sequenze ripetitive e isole CpG (regioni genomiche che contengono un’elevata densità di siti CpG la cui lunghezza è compresa tra le 300 e le 3.000 paia di basi e si trovano all’interno e nelle vicinanze dei promotori dei geni umani; la “p” nella notazione CpG si riferisce al legame fosfodiesterico tra la citosina e la guanina) e dotato anche di interfaccia grafica.

James Watson (a sinistra) e William Haseltine (a destra)

James Watson (a sinistra) e William Haseltine (a destra)

Si arrivò al 1992. In quell’anno e precisamente nel mese di aprile, J. Watson dopo una disputa con il direttore del NIH Bernardine Healy, si dimise dal suo incarico di direttore del Progetto genoma umano, per una questione dei brevetti per i geni. Nel mese di giugno C. Venter lasciò l’ NIH per guidare il TIGR (The Institute for Genomic Research) a Rockville nel Maryland, una nuova organizzazione non profit, che aveva ottenuto un finanziamento decennale di 70 milioni di dollari dalla Healthcare Investment Corporation.

Nel mese di giugno un biologo, imprenditore e filantropo statunitense William Haseltine già fondatore di diverse società di biotecnologia divenne amministratore delegato della Human Genome Sciences, una società che in seguito aprirà la strada nell’applicazione della genomica alla scoperta di nuovi farmaci, per la commercializzazione dei prodotti sviluppati dalle ricerche del TIGR mentre nel mese di luglio entrò nel Progetto Genoma Umano una società di ricerca britannica la Wellcome Trust con sede a Londra.
Melvin Simon e il suo gruppo nel frattempo svolsero un ruolo importante nel Progetto Genoma Umano sviluppando non solo un vettore batterico artificiale di DNA o BAC (bacterial artificial chromosome) ma costruendo anche molte delle librerie iniziali che fornirono materiale per il Progetto Genoma.

David Page e un laboratorio presso il CEPH

David Page e un laboratorio presso il CEPH

Nei mesi seguenti vennero completate alcune mappe fisiche rispettivamente del cromosoma Y ad opera del ricercatore statunitense David Page del Whitehead Institute con sede a Cambridge nello stato del Massachusetts e del cromosoma 21 da parte, invece, del ricercatore francese Daniel Cohen del Centre d’Etude du Polymorphisme Humain (CEPH) un centro di genetica internazionale situato a Parigi e dal Genethon a Evry.

Successivamente, vennero anche completate quelle genetiche del topo da Eric Lander dell’Institute Whitehead per una regione genetica di 4 cM e da Jean Weissenbach del CEPH per una regione invece di 5 cM per l’ uomo.

Si arrivò all’anno 1993 dove si rivide e si aggiornò il piano quinquennale prima della sua scadenza, elaborando procedure sperimentali più efficienti a causa dei molti progressi c ge erano stati compiuti in tempi più rapidi rispetto a quelli previsti. La scadenza fu prorogata al 1998 e alla quale si aggiunsero nuove finalità, tra cui la ricerca di marcatori genetici e la messa a punto di nuove tecniche di mappatura. Francis Collins e John Sulston assunsero il ruolo nel 1993 rispettivamente di direttori del National Human Genome Reserach Center negli U.S.A. e del Sanger Center in Inghilterra.  Da questo preciso momento questi due Enti diventarono i due più importanti laboratori di sequenziamento del Consorzio Internazionale.
Nello stesso periodo di tempo il database GeneBank (una banca dati open access, con tutte le sequenze di nucleotidi) ufficialmente venne mossa da Los Alamos al National Center for Biotechnology Information o NCBI, un Centro Nazionale per le InformazionI Biotecnologiche con sede a Bethesda nel Maryland e finalmente si concluse quella bagarre che per anni aveva coinvolto l’ NIH e il DOE per il controllo del Progetto Genoma Umano.
Lander - Weissenbach - Collins - SulstonNel 1994 furono pubblicati alcuni lavori sullo sviluppo di colororanti per il sequenziamento (PNAS) e sulla scoperta di nuove polimerasi termostabili su Nature mentre Science venne pubblicata nel 1995 sequenza nucleotidica completa di Hemophilus Influenzae di 1,8 Mb e di Mycoplasma genitalium di 0,59 Mb con l’approccio della cosiddetta metodologia “whole genome shotgun sequencing

Università Johns Hopkins di Baltimora

Università Johns Hopkins di Baltimora

La sequenza completa di questo primo organismo vivente fu resa possibile grazie a J. C. Venter e a Claire Frase del TIGR e a Hamilton Smith (Premio Nobel nel 1978 per la Medicina, per la scoperta degli enzimi di restrizione) dell’Università Johns Hopkins di Baltimora che convinse Venter , in questo studio, ad utilizzare un metodo di sequenziamento radicalmente nuovo, differente da quello convenzionale il cosiddetto “sequenziamento gerarchico” detto anche clone by clone, adoperato dal Consorzio Pubblico .che prevedeva di scomporre in frammenti il DNA contenuto in ogni cromosoma e di determinare l’ordine in cui i segmenti si succedevano. Una volta costruita questa mappa fisica del DNA, ogni segmento veniva sequenziato.

Questa nuova metodologia di sequenziamento consisteva nell’utilizzare enzimi di restrizione che avrebbero tagliato il DNA in tanti piccoli frammenti; poi i frammenti così ottenuti potevano essere sequenziati e l’ordine dei frammenti nel DNA originario avrebbe potuto essere ricostruito con il computer. In questo modo, si evitava la fase della costruzione della mappa fisica, che richiedeva molto tempo e che era decisamente dispendiosa, accelerando e rendendo meno costoso il processo di sequenziamento del genoma. In seguito questa nuova tecnologia di sequenziamento sarebbe stata chiamata “shotgun sequencing” o metodo a colpo di fucile, in quanto venivano prodotti frammenti di DNA a caso.
Nel dicembre del 1995, alcuni ricercatori al Whitehead e al Genthon guidati rispettivamente da Thomas Hudson e da E. Lander pubblicarono su Science una mappa fisica del genoma umano che conteneva 15.000 marcatori.

 

Una risposta a il Progetto Genoma Umano

  • Domenico Cavallero scrive:

    Molto interessante questa pubblicazione e come sempre complimenti al mio carissimo collega: Prof. Sergio Barocci.

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