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La scoperta della doppia elica del DNA

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di Sergio Barocci

[  continua dalla 1° parte:
Storia della scoperta degli acidi nucleici: prima della strutturistica di Watson e Crick”  ]

modello della struttura del DNA[…] Si arrivò così alla vigilia della scoperta della doppia elica del DNA: da sei anni Avery e collaboratori avevano pubblicato il loro classico lavoro in cui si dimostrava che il princìpio trasformante era il DNA . Insieme a scoperte successive , il lavoro di Avery e collaboratori ha costituito una prova sperimentale che il DNA e non le proteine rappresentava la molecola biologica dell’ereditarietà segnando l’inizio dell’era della biologia molecolare, anche se tale lavoro ebbe poco credito nella comunità scientifica di allora.
L’importanza del DNA nel meccanismo dell’ereditarietà divenne totale con l’esperimento del frullatore da parte di Alfred D. Hershey e di Martha Chase attraverso lo studio di batteri e batteriofagi. Tale esperimento a detta dello stesso Hershey, non rappresentava di certo l’esperimento migliore tra i tanti che consacrarono il DNA come la molecola portatrice dell’ereditarietà biologica.
Anche se era stato stabilito che il DNA era il materiale genetico di tutti gli organismi ad eccezione di alcuni virus e fornito alcuni dettagli su come alcuni componenti chimici di base costituivano gli acidi nucleici, rimaneva ancora da decifrare la struttura precisa del DNA cioè come venivano organizzate le catene polinucleotidiche in DNA che funzionava da materiale genetico. Il DNA era composto da una singola catena o da più di una ? Se il DNA era formato da due catene come si correlavano chimicamente una catena all’altra , come si diramavano le catene e come correlava la struttura del DNA alle varie funzioni come espressione, replicazione e mutazione?

A. D. Hershey

A. D. Hershey

Alfred Day Hershey (1908–1997) genetista statunitense e premio Nobel per la medicina nel 1969, insieme a Salvador Luria e Max Delbrück, per la scoperta della replicazione dei virus e della loro struttura genica.

M. C. Chase

M. C. Chase

Martha Cowles Chase (1927–2003), genetista statunitense e assistente di Alfred Hershey al Cold Spring Harbor Laboratory, Insieme dimostrarono usando traccianti radioattivi, che il materiale genetico di alcuni batteriofagi (virus che infettano i batteri) è costituito da DNA ed è responsabile delle capacità infettive.  L’esperimento di Hershey-Chase rappresenta la prova definitiva che il materiale genetico è costituito da DNA e non da proteine.

S. E. Luria

S. E. Luria

Salvador Edward Luria (1912–1991) microbiologo italiano, Premio Nobel per la medicina nel 1969 insieme a Max Delbrück e a Alfred D. Hershey per le loro scoperte sul meccanismo di replicazione e la struttura genetica dei virus.

 

L’esperimento di A. D. Hershey e M. Chase

Hershey A.D. and Chase M.” Independent functions of viral protein and nucleic acid in growth of bacteriophage” . J. Gen. Physiol 36: 39-56 (1952)

struttura del batteriofago T2 e fotografia al microscopio  elettronico

struttura del batteriofago T2 e fotografia al microscopio elettronico

L’esperimento di Alfred D. Hershey e Martha Chase provò definitivamente nel 1953 che il materiale genetico era costituito da DNA e non da proteine. In seguito a questi risultati incontrovertibili anche gli scienziati che avevano criticato l’esperimento di Avery, MacLeod e McCarty si convinsero dell’importantissimo ruolo biologico del DNA. Hershey e Chase svolsero i loro studi su un fago, cioè un virus in grado di infettare i batteri. Questo fago noto come “T2” era in grado di attaccare l’ Escherichia coli (un batterio Gram negativo appartenente alla famiglia delle Enterobacteriaceae e utilizzato spesso come modello per questo genere di studi).

All’epoca era noto che T2 era formato esclusivamente da DNA protetto da un involucro proteico. I due scienziati prepararono in parallelo due colture di E. coli:
1. Nel terreno di coltura della prima introdussero fosforo marcato radioattivamente (l’isotopo 32P).
2. Nel terreno di coltura della seconda introdussero zolfo marcato radioattivamente (l’isotopo 35S).

esperimento di Harsey e Chase

I batteri delle due colture metabolizzarono da una parte il fosforo marcato e dall’altra lo zolfo marcato introducendo questi atomi radioattivi nelle biomolecole presenti all’interno delle cellule.
In particolare:
a)   il fosforo marcato si troverà nei nucleotidi e di conseguenza anche negli acidi nucleici e non sarà presente invece in quantità significative nelle proteine;
b)   lo zolfo marcato si troverà nelle proteine (in particolare nell’amminoacido cisteina) e non si troverà nei nucleotidi.

colture di Escherichia coli in terreni radioattiviEssi infettarono poi parallelamente le due colture batteriche con il fago T2. Il virus utilizza l’apparato biosintetico delle cellule di E. coli per replicare il proprio DNA e per sintetizzare le proteine del rivestimento e quindi per costruire virus completi che causeranno poi la lisi o rottura della cellula batterica parassitata. Dal momento che i nucleotidi e gli amminoacidi utilizzati nella sintesi del DNA e delle proteine virali sono quelli presenti all’interno della cellula batterica infettata (cresciuta nutrendosi degli isotopi radioattivi). Ne risultò che i fagi sviluppati dall’ infezione nella prima coltura avevano un DNA marcato radioattivamente, mentre quelli sviluppati dall’infezione della seconda coltura avevano il rivestimento proteico esterno marcato radioattivamente.
Hershey e Chase separarono i fagi neoformati (quelli marcati) dai due terreni di coltura e, separatamente, li utilizzarono per infettare altre due colture di E. coli, in questo caso cresciute su terreni “standard” privi di isotopi radioattivi.

esperimento di Harsey e Chase con batteriofago T2

Nel caso in cui i fagi infettanti avevano il DNA marcato, in seguito all’infezione, gran parte della radioattività veniva misurata all’interno delle cellula batteriche colpite (e nel DNA di una parte dei nuovi fagi sviluppatisi in seguito a questa infezione).
Nel caso in cui i fagi infettanti avevano il rivestimento proteico marcato, la radioattività veniva misurata solamente all’esterno delle cellule batteriche colpite (e non era presente sul rivestimento proteico dei nuovi fagi sviluppatisi in seguito a questa infezione).

esperimento di Harsey e Chase

Il processo utilizzato per determinare se la radioattività provenisse dall’interno o dall’esterno delle cellule fu il seguente: dopo un certo tempo dall’inizio dell’infezione, il terreno di coltura veniva posto in un agitatore. La conseguente agitazione provocava il distacco del rivestimento proteico dei virus dalla membrana cellulare del batterio (in questo caso si parla di “ombre fagiche” poiché questi rivestimenti proteici non contengono il DNA che è già stato iniettato nella cellula). Il tutto veniva poi centrifugato: le cellule batteriche (contenenti eventualmente il DNA marcato) rimanevano sul fondo della provetta, mentre i rivestimenti proteici dei virus, distaccati dalle membrane cellulari dei batteri, rimanevano in sospensione. A seconda di dove si misurava la maggiore radioattività era possibile dedurre se la molecola marcata si trovasse o meno all’interno della cellula batterica.
trattamento con il waring blendorNel caso del DNA marcato la radioattività si misurò sul fondo della provetta (quindi all’interno dei batteri mentre nel caso delle proteine marcate la radioattività si misurò sul sopranatante (quindi all’esterno dei batteri). Dal momento che il fago per replicarsi ha bisogno di introdurre all’interno della cellula ospite il suo materiale genetico per poter sfruttare l’apparato batterico di biosintesi, appare evidente che questo materiale genetico deve essere per forza il DNA poiché, come dimostrato, le proteine non entrano nella cellula colpita mentre il DNA sì.

In conclusione l’esperimento di Hershey e Chase dimostrò che :
1.   il materiale genetico che portava l’informazione per la produzione di nuove particelle fagiche che si recuperavano dal sedimento veniva marcato dal fosforo e non dallo zolfo.
2.   pertanto, l’informazione genetica risiedeva nel DNA del batteriofago.

A questo punto rimaneva aperta un’ultima questione: “Di cosa era fatto il materiale genetico degli “organismi” che non contenevano DNA (i virus a RNA)?”.   La risposta a questa domanda non tardò ad arrivare in seguito agli studi condotti sul virus del mosaico del tabacco (TMV) da Gierer e Schramm nel 1956 e da Fraenkel-Conrat e Singer ne 1957.

frullatore simile a quello utilizzato da Hershey e Chase

frullatore simile a quello utilizzato da Hershey e Chase

Lo stesso Hershey fornì un resoconto chiarissimo dell’esperimento del frullatore:
“L’esperimento del frullatore è stato descritto in modo non corretto in molti libri di testo. Nella speranza di preservarne l’essenziale semplicità, voglio ripercorrerlo brevemente qui. Una sospensione batterica esposta al batteriofago T2 e poi rapidamente raffreddata in ghiaccio, viene frullata in un Waring Blendor e poi centrifugata brevemente ad una velocità sufficiente a far sedimentare i batteri in fondo ad una provetta. Si ottengono così due frazioni: un sedimento che contiene i batteri infettati ed un sovranatante che contiene tutte le particelle più piccole dei batteri. Ciascuna delle due frazioni viene analizzata per la presenza di radiofosforo nel DNA o di radiozolfo nelle proteine, con i quali le particelle fagiche erano state precedentemente marcate in esperimenti separati.”

I risultati sono i seguenti:

1.   La maggior parte del DNA fagico (radiofosforo) sedimenta con le cellule batteriche
2.   La maggior parte delle proteine fagiche (radiozolfo) si ritrova nel surnatante.
3.   La maggior parte dei batteri originariamente infettati rimane capace di produrre fago.
4.   Se si omette il trattamento con il frullatore, sia le proteine, sia il DNA fagico sedimentano con i batteri.
5.   Le proteine fagiche rimosse dalle cellule per mezzo del frullatore consistono in particelle fagiche vuote, più o meno intatte, che possono quindi essere considerate come veicoli passivi per il trasporto del DNA da una cellula batterica a quella successiva e che, una volta svolto il loro compito, non giocano più alcun ruolo nella replicazione del fago.”

Max L. H. Delbruck

Max L. H. Delbruck

Max Ludwig Henning Delbrück (1906–1981) biologo tedesco naturalizzato statunitense e premio Nobel per la medicina nel 1969, insieme a Salvador Luria e Alfred Hershey.

Nel 1944 Avery e colleghi avevano dimostrato che il portatore dei caratteri genetici era costituito dall’acido desossiribonucleico, ovvero il DNA. Qualche anno più tardi, nel 1952, questi risultati furono confermati dall’esperimento di Alfred Day Hershey e Martha Chase che convinse definitivamente anche gli scienziati più scettici. Alla fine degli anni ’40 un gruppo di ricercatori, guidati dal biochimico austriaco Erwin Chargaff, cercò di comprendere meglio le peculiarità del DNA. Quali caratteristiche chimiche permettevano a questa molecola di contenere le informazioni genetiche? Era uno dei primi importanti passi verso la comprensione della struttura dell’acido desossiribonucleico. Oltre a Chargaff altri scienziati tra il 1949 e il 1953 furono interessati a risolvere la struttura del DNA. Tra questi anche Rosalind Franklin , Linus Pauling, Maurice Wilkins, James Watson e Francis Crick che cercarono una qualche informazione che potesse rispondere a quella che molti consideravano la questione più significativa cioè come faceva il DNA a funzionare da base genetica per i processi vitali ? Si ritenne che la risposta dipendesse fortemente dalla struttura chimica e dall’organizzazione della molecola di DNA. Gli sforzi furono premiati quando nel 1953 James Watson e Francis Crick avanzarono la loro ipotesi sulla natura a doppia elica del DNA, senza fare alcun esperimento ma costruendo dei modelli (in cartone e filo di ferro).
Fu provata la correttezza dell’assunzione che le funzioni del DNA sarebbero state più semplici da chiarire una volta determinata la sua struttura generale. Infatti, fino al 1944 alcune osservazioni favorivano le proteine come materiale genetico.
James Watson e Francis Crick presentarono nel 1953, sulla rivista Nature , quello che oggi viene accertato come il primo modello accurato della struttura del DNA, ossia il modello della doppia elica  a disegnarne il bozzetto fu la moglie pittrice Odile Speed dello stesso). I dati sperimentali cruciali per lo sviluppo del loro modello provenivano soprattutto da due fonti: i rapporti quantitativi tra le basi azotate e gli studi di diffrazione a raggi X del DNA.

1.  Rapporti quantitativi tra le basi azotate (Erwin Chargaff)

a)   Qualunque sia la fonte del DNA: Pu (purine) = Py (pirimidine) (A+G=T+C) A = T C = G
b)   La composizione in basi del DNA, espressa come la percentuale G+C% è costante per ciascuna specie, ma varia moltissimo da una specie all’altra.

composizione in basi azotate del DNA di diverse specie

composizione in basi azotate del DNA di diverse specie

La composizione in basi del DNA è molto variabile, ma invariabilmente [A]=[T] e [Pu]=[Py]
Nella struttura del DNA sono coinvolti legami-idrogeno. La viscosità del DNA diminuisce drasticamente a temperature tra 70° e 80° C, indicando che legami chimici termosensibili, quali i legami idrogeno, sono importanti per la struttura.

 

 

2.   Studi di diffrazione a raggi X del DNA (Astbury, Wilkins, Franklin)

Nota introduttiva sulla cristallografia a raggi X

Nei cristalli le molecole sono ordinate in un reticolo. Quando ad esempio un raggio X incontra un particolare atomo in un cristallo, viene deviato di un angolo caratteristico (deflessione). Un fascio di raggi X diretto su un cristallo viene suddiviso in fasci più piccoli, che lasciano il cristallo con angolazioni diverse e interferiscono gli uni con gli altri, rafforzandosi o annullandosi (interferenza).
L’azione del raggio è proporzionale a:
a) distanza tra gli atomi;
b) lunghezza d’onda della radiazione.

La diffrazione (somma di deflessione e interferenza) genera sulla lastra fotografica un diffrattogramma, cioè un insieme di macchie, il cui numero dipende dalla complessità della molecola cristallizzata. Ogni macchia indica l’esistenza di moduli (gruppi di atomi) ripetitivi. La distanza del centro di una macchia è inversamente proporzionale alla spaziatura tra moduli ripetitivi:
a) macchie centrali: spaziature più ampie;
b) macchie periferiche: spaziature più piccole.

Una fibra di DNA, costituita da fasci di molecole parallele, equivale ad una struttura cristallina.

Le macchie meridiane: moduli che si ripetono lungo l’asse mentre le  macchie equatoriali: moduli che si ripetono perpendicolarmente all’asse

Le macchie meridiane: moduli che si ripetono lungo l’asse mentre le macchie equatoriali: moduli che si ripetono perpendicolarmente all’asse

Le macchie meridiane: moduli che si ripetono lungo l’asse mentre le macchie equatoriali: moduli che si ripetono perpendicolarmente all’asse.
La molecola del DNA è quindi una fibra cilindrica (diametro 2 nm); le basi (strutture planari) sono impaccate come una pila di monete con i piani centrali distanziati di 0,34 nm (periodo minore). La fibra non è retta, ma spirale, avvolta ad elica attorno a un asse centrale. Un giro dell’elica misura 3,4 nm (periodo maggiore), un multiplo di 10 della distanza tra basi contigue. Comparando la densità misurata del DNA (circa 1,75 g/cm3) e quella calcolata sulla base della spaziatura atomica, si deduceva che il DNA doveva essere composto da più di una catena polinucleotidica (forse 2 o 3 catene).
Quindi, il successo di Watson e Crick fu attribuito alla costruzione di un modello che concordava con le informazioni precedenti Essi ipotizzarono che la molecola del DNA fosse costituita da una doppia elica, cioè da due catene polinucleotidiche spiralizzate con avvolgimento destrorso attorno a un unico asse, connesse tra di loro da legami-idrogeno. Proposero che i legami-idrogeno connettessero tra loro le coppie di basi note per essere presenti in quantità uguali, cioè A con T e C con G. Le risultanti strutture risultano planari, perpendicolari all’asse e di dimensioni identiche (garantendo quindi un diametro costante per la doppia elica, indipendente dalla sequenza delle basi).

coppie di basi normali presenti nel DNA

coppie di basi normali presenti nel DNA

Le coppie di basi sono complanari; i desossiribosi giacciono su piani perpendicolari a quelli delle basi
Le catene pentoso – fosfato – pentoso – fosfato… sono fortemente anioniche e si devono trovare all’esterno della molecola a contatto con l’acqua, mentre le coppie di basi, idrofobiche, si impaccano le une sulle altre al centro della molecola, escludendo l’acqua. Avvicinando due filamenti di DNA c’è repulsione causata dalle cariche negative.
Tra le basi che si fronteggiano si formano dei legami idrogeno:

1.  Due tra A e T;
2.  Tre tra C e G.

coppie di basi azotate "proibite" e mutagene

coppie di basi azotate “proibite” e mutagene

Se prevalgono le citosine e le guanine, il numero di legami idrogeno è molto maggiore che se prevalgono adenine e timine. Quando prevalgono C e G il DNA si denatura ad una temperatura maggiore. Tra le basi si instaurano interazioni idrofobiche che stabilizzano ulteriormente la molecola. Ciascuna catena ha un’estremità 3’ e un’estremità 5’. Le due catene della doppia elica sono disposte in modo antiparallelo in quanto i legami fosfodiesterici che uniscono i pentosi contigui hanno polarità opposte. In altre parole, in corrispondenza di ciascuna delle due estremità della doppia elica, il terminale 5’ di una catena si confronta con il terminale 3’ dell’altra catena.
Le due eliche differiscono quindi per polarità, per sequenza e per composizione in basi, ma sono perfettamente complementari, cioè la sequenza di una catena è completamente determinata da quella della catena opposta. Le due eliche parentali si srotolano e ciascuna fa da stampo per la sintesi di un’elica-figlia secondo le regole dell’appaiamento delle basi (A=T; C=G).
L’elevata capacità informativa del DNA si spiega con la sequenza dei nucleotidi. Quando la cellula va incontro a divisione, la doppia elica si apre grazie all’azione di enzimi specifici. Ciascuna elica funge da stampo per una nuova catena di DNA, secondo le regole dell’appaiamento delle basi.
Il DNA è chimicamente molto stabile, mentre l’RNA è molto suscettibile di degradazione. Durante ogni ciclo di divisione possono introdursi errori (tautomerie). Una timina tautomeria può legarsi ad un nucleotide che non sia l’adenina. La probabilità è di 1/1000. Il DNA umano è formato da 3 miliardi di nucleotidi.
Il modello di Watson e Crick prevedeva inoltre che le due eliche fossero antiparallele e che la replicazione del DNA fosse di tipo semi-conservativa (un filamento vecchio e uno nuovo).

modello del DNA di Crick e Watson

modello del DNA di Crick e Watson

Il modello del DNA a doppia elica. Francis Crick (a sinistra) e James Watson (a destra) proposero una struttura a doppia elica per la molecola del DNA. Oggi, i biochimici possono conoscere la posizione di ciascun atomo in una macromolecola di DNA
Le evidenze sperimentali a supporto del loro modello furono riportate in una serie di cinque articoli pubblicati sullo stesso numero di Nature del 25 aprile 1953 Tra questi articoli figurava anche quello di Rosalind Franklin e di Raymond Gosling, che conteneva i dati di diffrazione a raggi X, fondamentale per sostenere il modello. Il numero di Nature conteneva anche un articolo sulla struttura del DNA scritto da Maurice Wilkins.

E. Chargaff

E. Chargaff

Erwin Chargaff (1905–2002) biochimico austriaco. Viene ricordato per le sue regole, enunciate nel 1950, che diedero un importante contributo nella determinazione della struttura della molecola di DNA. Egli alla fine degli anni ’40 usando la tecnica di cromatografia su carta riuscì a separare i DNA di diverse specie la molecola del DNA nelle sue basi costituenti e a determinarne la loro percentuale . I suoi studi sulla composizione delle basi furono critici per il modello vincente del DNA portato avanti da Watson e Crick in quanto i suoi dati indicarono che la quantità di purine è sempre uguale a quella di pirimidine. Tali ricerche lo portarono a formulare alcune fondamentali considerazioni sulle caratteristiche del DNA.

Regole di Erwin Chargaff alla fine degli anni ‘40:
1.   La composizione in basi varia da una specie all’altra.
2.   Le molecole di DNA isolate da tessuti diversi della stessa specie hanno la stessa composizione in basi.
3.   La composizione in basi del DNA di una data specie non si modifica con ò’età dell’organismo, con lo stato nutrizionale o in seguito a variazioni ambientali.
4.   In tutte le molecole del DNA, indipendentemente dalla specie cui appartiene, la quantità di adenina eguaglia quella di timina e la quantità di citosina quella di guanina (%A = %T; %C = %G) [( rapporto 1:1 tra le basi puriniche (A+G) e le basi pirimidiniche (T+C)].

A+G/T+C= 1 A=T; A/T=1 G=C ; G/C=1

regole di ChargaffQueste semplici regole hanno rappresentato uno degli elementi essenziali che hanno permesso la formulazione del modello di DNA da parte di James Watson e Francis Crick.  Grazie anche a queste regole si è dedotto il corretto appaiamento delle basi azotate tra i due filamenti del DNA.

Estensioni alle regole

Nel 2006 si è dimostrato che il rapporto 1:1 tra le basi puriniche (A+G) e le basi pirimidiniche (T+C) contenute nel DNA di una cellula è valido per quattro dei cinque tipi di genoma con DNA a doppio filamento esistenti: quello eucariotico, procariotico (o batterico), quello virale e quello degli archebatteri. Non è invece applicabile per i genomi dei mitocondri e dei cloroplasti. Non vale inoltre neanche per i genomi di DNA a singolo filamento (presenti soltanto in alcuni virus). L’origine della deviazione dalle regole di Chargaff negli organelli si pensa sia legata al particolare meccanismo di replicazione che essi adoperano. . Durante la replicazione infatti i filamenti di DNA si separano; sul DNA a singolo filamento la citosina lentamente va incontro a deaminazione trasformandosi in timina. Maggiore è il tempo nel quale il filamento è separato maggiore è la frequenza con cui la citosina deamina spontaneamente. Per ragioni non ancora chiare i filamenti tendono a restare separati molto di più negli organelli che non nel DNA cromosomico. Il processo tende quindi a formare un filamento di DNA con più timina e guanina del normale; l’altro con più adenina e citosina. I dati sulla sequenza di questi genomi hanno confermato questa ipotesi.

Analisi di diffrazione ai raggi X del DNA

L’analisi di diffrazione ai raggi X fu applicata con successo da L. Pauling e altri chimici allo studio della struutura delle proteine. All’inizio del 1938 tale tecnica fu provata da W. Astbury sul DNA e nel 1947 rivelò una periodicità di 3,4 A° che gli suggerì che le basi fossero impilate come monete uan sulla testa dell’altra. Tra il 1950 e il 1953 R. Franklin mentre stava lavorando nel Laboratorio diretto da M. Wilkins ottenne da campioni di DNA maggiormente purificati alcuni dati di raggi X di migliore qualità. Il suo studio confermò la periodicità di 3,4 A° vista da Astbury e suggerì che la struttura fosse una sorte di elica. Tuttavia, R. Franklin non propose un modello definitivo

Rosalind Elsie Franklin (1920–1958) chimica e fisica britannica, l’eroina della biologia molecolare che analizzò insieme M. Wilkins all’inizio degli anni ‘50 i cristalli di DNA con il metodo della diffrazione dei raggi X. Essi videro che I polimeri di DNA erano elicoidali con 2 periodicità lungo il loro asse: una primaria di 3,4 Å e una secondaria di 34 Å. Rosalind FranKlin era figlia di un banchiere. Aveva deciso di diventare scienziata a 15 anni, e a 18 era entrata a Cambridge causando una crisi familiare: il padre, convinto che il posto di una donna non fosse in laboratorio né all’università, aveva rifiutato di pagare l’iscrizione. A ventisei anni , aveva pubblicato già cinque articoli e completato il dottorato. Cominciò a lavorare alla diffrazione a raggi X e rivelò subito abilità e ingegno da fuoriclasse. Fu fra i primi scienziati a usare i raggi X non per studiare cristalli ma materiali complessi come le molecole biologiche.

R. E. Franklin

R. E. Franklin

Un anno prima che Crick e Watson si gettassero sul DNA , Franklin entrò al King’s College di Londra, sotto la supervisione di M. Wilkins. I due sembra che non si piacessero affatto: Wilkins era timido e riflessivo mentre R. Franklin era diretta. Ella considerò sempre lo studio del DNA il proprio progetto di ricerca mentre Wilkins al contrario, ritenne che il DNA era affar suo e trattò la scienziata come un’assistente. R. Franklin considerò M. Wilkins un ricercatore “middle-class “ e i suoi colleghi “repellenti”. U na volta , ella scrisse: “mi sono organizzata in maniera da non vedere nessuno di loro quasi mai. Tra loro non c’è alcuna mente di prima categoria, e neanche una semplicemente buona. In pratica non trovo nessuno col quale potesse desiderare di intavolare una discussione, scientifica o su altri argomenti”. Discutere coi maschi, d’altronde in quel tempo, non era semplice. Le donne del laboratorio non erano ammesse a mangiare con i colleghi in sala mensa.  R. Franklin modificò i propri macchinari e riuscì a ottenere un fascio estremamente sottile di raggi X e fu capace, con i suoi studenti, di produrre campioni minuscoli di DNA e di sistemarli in fibre perfettamente paralleli. Scoprì che la molecola assumeva forme diverse in funzione dell’umidità dell’aria. Mostrò che la molecola di fosfato che fa da impalcatura alla struttura doveva essere sul lato esterno del DNA e che, almeno nella forma “ umida” , il DNA doveva avere forma elicoidale: una specie di scala a chiocciola. Tuttavia, rigorosa e prudente all’eccesso, decide di non pubblicare nulla prima di avere prove conclusive. Nel 1951 J.Watson assistette a un seminario della Franklin ed ebbe l’opportunità di osservare le sue foto e di ascoltarla .Per sua stessa ammissione, ammise di aver capito poco. J. Watson tornò a Cambridge con due consapevolezze: 1) non gli piacque l’aspetto fisico né lo stile della Franklin e 2) che il DNA doveva avere qualcosa a che fare con un’elica. Basandosi su questo, F. Crick e Watson costruirono in una settimana un modellino di DNA. Questo modellino risultò in tre filamenti, il fosforo sul lato interno e le basi azotate che spuntavano fuori dalla molecola. Tale modello venne poi spedito a R. Franklin per un consiglio ma ella lo bocciò come “inconsistente coi dati sperimentali”. In realtà era così sballato che il capo sezione dei due ricercatori intimò loro di lasciar perdere il DNA e trovare un argomento nel quale fossero competenti. Ma pochi mesi dopo alcuni colpi di fortuna ( la conoscenza di M. Wilkins che consegnò loro la famosa foto 51 fatta da R. Franklin e a sua insaputa dove veniva mostrata la forma di un’elica e la dimensione esatta del diametro della molecola del DNA) , di astuzia e di genio ( le scoperte di E. Chargaff ) destinarono a J. Watson e a F. Crick l’opportunità di ricevere il premio Nobel. Lo stesso J. Watson scriverà in seguito: “nell’istante in cui vidi quell’immagine rimasi a bocca aperta. Molti dei parametri vitali dell’elica erano lì “. Anche F. Crick ammetterà: “senza quei dati la formulazione del nostro modello sarebbe stata altamente improbabile, se non impossibile.

fotografia a raggi X del DNA (originale di R. Franklin)

La fotografia di R. Franklin, disegnata da J. Watson, fu utilizzata da F. Crick per calcolare alcuni parametri dell’elica. Si tratta di una fotografia di diffrazione a raggi X della forma B di fibre di DNA purificato. Gli archi marcati sulla periferia mostravano aspetti della molecola strettamente spaziati che fornivano una stima della periodicità delle basi azotate distanziate di 3,4 A (angstrom) . Il profilo interno di macchie a croce mostrava l’aspetto più grossolano della molecola indicante la sua natura a elica. Il DNA era precipitato con una soluzione concentrata di etanolo e formava delle fibre in cui le eliche si impacchettavano a formare Il delle strutture simili a cristalli (cristalliti) che potevano essere analizzate mediante diffrazione con raggi

Nel 1962, dopo la morte di Rosalind Franklin (a causa di un tumore provocato, probabilmente, dalle alte dosi di raggi X a cui si era esposta nel corso dei suoi esperimenti), Watson, Crick e Wilkins ricevettero congiuntamente il Premio Nobel per la medicina e la doppia elica contribuí a portare la molecola del DNA alla ribalta. Dal momento che la scoperta del modello si basò essenzialmente sui dati di Rosalind Franklin, ancora oggi esistono pareri molto eterogenei nella comunità scientifica su chi avrebbe dovuto ricevere tale premio.

Nel 1958, Crick propose in una importante comunicazione il dogma centrale della biologia molecolare, che fissava le relazioni tra DNA, RNA e proteine.

Dogma centrale della biologia molecolare:

a)   il DNA è il portatore dell’informazione genetica;
b)   il processo di replicazionecre nuove coppie di DNA;
c)  il processo della trascrizione crea RNA utilizzando le informazioni del DNA;
d)   il processo di traduzione crea le proteine usando le informazioni dell’RNA.

Nel frattempo sempre nel 1958 Francois Jacob e Jacques Monod intuirono l’esistenza di un intermediario instabile, l’RNA messaggero, la molecola che fa da collegamento tra l’informazione contenuta nel DNA e quella espressa nelle proteine cioè la molecola che portava l’informazione al DNA dal nucleo della cellula alla fattoria di proteine (i ribosomi) nel citoplasma. Nel 1958 vi fu anche la conferma finale del meccanismo di replicazione basato sulla struttura a doppia elica fornita dall’esperimento di M. Meselson e F. Stahl ( esperimento fondamentale per determinare il meccanismo semiconservativo di replicazione del DNA)

J. D. Watson

J. D. Watson

James D. Watson (1928 – ) biologo statunitense. Nasce a Chicago il 6 aprile del 1928 da genitori di lontane origini anglo-irlandesi. I suoi studi accademici fino al Ph.D. ottenuto nel 1950 presso l’Università dell’Indiana a Bloomington , riguardano prevalentemente la zoologia ma i suoi interessi incominciano ad essere fortemente influenzati da alcuni genetisti come H. J. Muller (1890 – 1967) vincitore del Premio Nobel per la medicina nel 1946 per la scoperta dell’induzione di mutazioni da parte dei raggi X e T.M. Sonnebon (1905-1981) ma soprattutto dal microbiologo italiano S. E .Luria che all’epoca lavorava presso il Dipartimento di Batteriologia dell’Università dell’Indiana. La tesi di dottorato di Watson, sotto la guida di Luria, è uno studio sull’effetto dei raggi X duri sulla moltiplicazione dei batteri. Dal settembre 1950 al settembre 1951 trascorre il suo primo anno di post-dottorato a Copenaghen come Merck Fellow del National Research Council. Nuovamente, lavora sui virus batterici , tentando di studiare il destino del DNA delle particelle virali infettanti. Nella primavera del 1951 si reca nella stazione zoologica di Napoli e qui incontra M. H. Wilkins e ha per la prima volta la possibilità di osservare la diffrazione ai raggi X del DNA cristallino. Questo, lo stimola fortemente a cambiare la direzione delle proprie ricerca verso la chimica strutturale degli acidi nucleici e delle proteine , resa anche possibile da Luria presso il Cavendish Laboratory of Cambridge, dove inizia a lavorare nell’ottobre del 1952. In questo laboratorio, incontra F. Crick interessato anch’egli a risolvere la struttura del DNA. I loro sforzi comuni culminano nella proposta del marzo 1953 della configurazione complementare a doppia elica del DNA, che varrà a loro il riconoscimento del Premio Nobel per la chimica nel 1962 insieme a Maurice H. Wilkins. Dal 1953 al 1955 J. Watson lavora presso il California Institute of Technology per poi ritornare al Cavendish Laboratory di Cambridge e riprendere insieme a F. Crick gli studi sulla struttura ultramicroscopica dei virus. Nel 1961 diventa professore di Biologia molecolare all’Harvard University nel Massachusetts.

Cold Spring Harbor Laboratory

Cold Spring Harbor Laboratory

Nel 1962 riceve insieme a Francis Crick e Maurice Wilkins il Premio Nobel per la Medicina per gli studi condotti sugli acidi nucleici che portano a determinare il modello tridimensionale a doppia elica del DNA e nel 1968 assume la direzione del Laboratory of Quantitative Biology a Cold Spring Harbor presso Oyster Bay, nello stato di New York, indirizzando la sua ricerca nel campo della virologia tumorale. Grazie al suo lavoro svolto a Cold Spring , oggi si ha una migliore comprensione degli oncogeni e delle basi molecolari del cancro. Dal 1988 al 1992 è direttore del Centro Nazionale per il Progetto Genoma Umano negli U.S.A.

F. H. C. Crick

F. H. C. Crick

Francis H. C. Crick (1916–2004) fisico britannico, Premio Nobel per la Medicina nel 1962, insieme a James Watson e a Maurice Wilkins . Nasce a Northampton l’ 8 giugno del 1916 in Inghilterra. La sua formazione accademica è inizialmente orientata alla fisica ma viene interrotta dallo scoppio della 2° guerra mondiale nel 1939. Durante la guerra, lavora per la Marina Britannica al rilevamento magnetico e acustico delle mine. Lascia l’Ammiragliato nel 1947 per dedicarsi alla biologia. Grazie ad una borsa di studio del Medical Research Council, Crick inizia a lavorare allo Strangeways Research Laboratory di Cambridge e dal 1949 si unisce alla Medical Research Council Unit diretta da Max F. Perutz . La squadra di Perutz era formata oltre cha da Crick anche dal chimico John Kendrew e da uno studente di nome Hugh Huxley che in seguito diventerà famoso per aver dimostrato che il meccanismo della contrazione muscolare non si ha in seguito a modifiche della struttura di actina e miosina, ma allo scorrimento di queste ultime le une sulle altre utilizzante l’ATP come fonte energetica. Nel 1954 Crick ottiene il Ph.D. con una tesi dal titolo “Diffrazione ai raggi X : polipeptidi e proteine” Ma prima di allora, nel 1953, la sua collaborazione con J. Watson (iniziata nel 1951) lo avrebbe portato al grande risultato che gli sarebbe valso il Premio Nobel : la proposta della struttura a doppia elica e del relativo schema di replicazione . Crick e Watson pubblicarono il 1° dei loro quattro articoli su questa scoperta nel numero del 25 aprile 1953 sulla rivista “Nature”.  Più tardi, insieme, proporranno anche una teoria generale sulla struttura dei virus. Il nome di Crick oltre alla scoperta della doppia elica è legato anche ad un grande numero di altre scoperte fondamentali come ad esempio l’individuazione della funzione del materiale genetico nella determinazione della specificità delle proteine collaborando con V. Ingram.

Salk Institute

Salk Institute

Nel 1957, inizia a lavorare con Sydney Brenner per determinare in che modo la sequenza di basi del DNA riesca a specificare la sequenza aminoacidica delle proteine. In poche parole, entrambi avevano come scopo quello di risolvere il codice genetico. Nel 1958, dopo svariate ipotesi, Crick consegnò alla Società di Biologia Sperimentale quello che probabilmente è il suo articolo più notevole, dal titolo “Sulla sintesi delle proteine” in cui spiegò come la funzione dei geni fosse quella di creare proteine, costituite da venti tipi di amminoacidi. In questo articolo, egli, usa l’espressione dogma centrale per esprimere l’idea che il flusso dell’informazione genetica nelle cellule è unidirezionale, dal DNA all’RNA e dal RNA alle proteine. Dopo aver teorizzato la struttura del codice genetico, si dedicò ad una serie di esperimenti che mostrarono come tale codice fosse degenerato e triplice. Gli esperimenti dimostrarono anche come il codice dovesse essere letto a partire da un punto preciso da cui poi iniziare a contare di tre in tre. I risultati furono esposti nell’articolo “ Natura generale del codice genetico per le proteine” che venne pubblicato il 30 dicembre del 1961 su Nature con L. Barnett, S. Brenner e il giovane fisico Richard J. Watts-Tobin come coautori. Negli anni successivi divenne il supervisore di una serie di esperimenti che avevano come scopo quello di assegnare ciascuna tripletta di basi ad uno specifico amminoacido. Agli inizi del 1966 tutti i codoni erano stati individuati e decifrati, tranne l’UGA, il cui significato venne scoperto solo alla fine di ottobre grazie al lavoro di Leslie Barnett (1920–2002).  Il codice genetico era stato finalmente risolto. Fu il completamento di cinque anni di duro lavoro e cooperazione fra i vari gruppi impegnati nella stessa ricerca di cui Crick era stato il teorico.

Francis H. C. Crick: "The Astonishining Hypothesis: The Scientific for the Soul"

Francis H. C. Crick: “The Astonishining Hypothesis: The Scientific for the Soul”

Nel 1976 passa al Salk Institute for Biological Studies , a La Jolla in California, dove incomincia a dedicarsi agli studi sul funzionamento del cervello. In particolare, egli è persuaso che il fenomeno della coscienza, come ogni altro fenomeno mentale, possa essere spiegato attraverso modelli scientifici del tutto simili a quelli che hanno permesso di spiegare la trasmissione dell’informazione genetica per mezzo del DNA. Su questo tema, nel 1994, F. Crick scrive un testo “The Astonishining Hypothesis: The Scientific for the Soul” Nel 1986, conosce Christof Koch, anch’egli interessato alla reale costituzione del cervello. Quest’ultimo diventerà per circa diciotto anni il compagno di conversazione di Crick , ruolo che in passato era stato coperto da Watson e Brenner. L’obiettivo che i due si posero era la coscienza. A conclusione di anni di lavoro e studio nel 2003 Crick e Koch pubblicano un articolo dal titolo “ Una struttura per la coscienza” Nel 1995, la salute di Crick peggiora . Viene sottoposto a un delicato intervento di bypass e più tardi a causa di una neoplasia al colon muore il 28 luglio 2004.

M. H. Wilkins

M. H. Wilkins

Maurice H. Wilkins (1916 – 2004) biologo neozelandese naturalizzato britannico, premio Nobel per la medicina nel 1962, insieme a Francis Crick e James Watson, per le scoperte riguardo alla struttura molecolare degli acidi nucleici. Wilkins si laureò in fisica nel 1938 a Cambridge in Inghilterra e poi si trasferì all’Università di Birmingham dove ottenne il dottorato lavorando con John T. Randall alla teoria della fosforescenza e della luminescenza. Durante il secondo conflitto mondiale lavorò al perfezionamento degli schermi radar a tubo catodico e poi alla separazione per mezzo di spettrografo di massa degli isotopi dell’uranio da utilizzare per la bomba atomica. Nel 1946 si trasferì con Randall al King’s College di Londra entrando a far parte del Medical Research Council dove diresse l’unità di ricerca in biofisica. Nel 1970 sempre al King’s College divenne professore di biofisica e direttore del Dipartimento. Nel 1946 quando non si sapeva ancora che il DNA fosse il responsabile del codice genetico, Wilkins incominciò ad occuparsi del DNA in quanto era una molecola facilmente isolabile e che poteva essere studiata all’U.V. Solo casualmente osservando al microscopio gel di DNA si accorse che era facile staccarne sottili fibre con un bastoncino di vetro. L’uniformità delle fibre gli fece pensare che il DNA avesse una struttura regolare cristallina o semi cristallina che poteva essere studiata con la diffrazione dei raggi X analogamente a quanto faceva per le proteine John D. Bernal. Le figure di diffrazione che ottenne confermarono la regolarità delle molecole di DNA e fecero pensare che esse fossero elicoidali. Successivamente vide che l’elica aveva un diametro di 2 nm , un passo di circa 3,4 nm e che vi erano dei gruppi fosforici disposti all’esterno dell’unità strutturale. Le misure della densità indicavano inoltre che vi erano due molecole coassiali e suggerivano che le basi azotate fossero disposte in pile al centro dell’elica. Era ciò che esattamente Watson e Crick avevano proposto con i loro modelli molecolari costruiti in base a calcoli teorici.

monumento a M. Wilkins a Pongaroa, in Nuova Zelanda

monumento a M. Wilkins a Pongaroa, in Nuova Zelanda

Pertanto, quando di parla di struttura della doppia elica, si pensa sempre al binomio Watson –Crick, ma bisogna tener presente il ruolo che svolse M. Wilkins nella scoperta della struttura del DNA grazie ai suoi esperimenti di diffrazione dei raggi X che fornirono la prova dell’esistenza della doppia elica. Per questo motivo che Wilkins condivise giustamente il Premio Nobel con i suoi due colleghi divenuti in seguito più famosi, mentre R. Franklin sua collaboratrice , morta quattro anni prima, non fu neppure menzionata.

F. Jacob

F. Jacob

François Jacob (1920–2013) biologo francese, nasce a Nancy il 7 giugno del 1920. Si arruola nell’esercito durante la 2° guerra mondiale. Nel 1950 fa parte del reparto di Fisiologia microbica dell’Istituto Pasteur di Parigi. Nel 1954 riceve insieme ad André Lwoff e Jacques Monod, il Premio Nobel per la Medicina per gli studi condotti sui meccanismi genetici dei batteri e dei virus e per gli studi sui fenomeni della coniugazione dei batteri Escherichia Coli. Francois Jacob muore nel 2013.

J. L. Monod

J. L. Monod

Jacques Lucien Monod (1910–1976) biologo francese. Nasce a Parigi il 10 febbraio del 1910. Nel 1931 si laurea in Scienze Biologiche . Nel 1941 consegue il dottorato in Scienze alla Sorbona. Dal 1971 ricopre la carica di direttore generale dell’Istituto Pasteur. Il suo nome è legato alla teoria dell’operone , un sistema secondo cui i geni , si autoregolano in maniera coordinata. Nel 1965 insieme a Francois Jacob e ad André Lwoff , riceve il Premio Nobel per la Medicina per le ricerche sulla regolazione della sintesi degli enzimi nei microorganismi. Jacques Monod muore nel 1976.

Sorbona ed Istituto Pasteur

la Sorbona (a sinistra) e l’Istituto Pasteur (a destra)

L´idea che però la molecola del DNA fosse costituita da un’elica non era affatto nuova: già il chimico Linus Pauling, vincitore di ben due premi Nobel (per la chimica e la pace), aveva annunciato proprio nel 1953 un modello a tripla elica con i gruppi fosfato all’interno. Incredibilmente, egli scrisse un libro sulla natura del legame chimico non considerando che le forze repulsive generate dalle cariche negative dei gruppi fosfati avrebbero fatto collassare la struttura.

Linus Carl Pauling

L. C. Pauling

Linus Carl Pauling (1901–1994) chimico statunitense.  Si colloca tra i più celebri scienziati del ventesimo secolo. E’ stato vincitore di due premi Nobel (non condivisi) per la chimica nel 1954 (per le sue ricerche nel campo dell’attrazione molecolare e le sue applicazioni per la spiegazione della struttura di sostanze complesse) e per la pace nel 1962.

Anche lo stesso Maurice Wilkins era convinto che si trattasse di un’elica, e cercò di determinarla non mediante modelli come Watson e Crick, ma attraverso la diffrazione a raggi X.  Le fotografie del suo laboratorio fornirono una conferma della struttura e Wilkins condivise con loro il premio Nobel nel 1962.  Prima ancora che a Watson, Crick e Wilkins, il premio era andato nel 1959 ad Arthur Kornberg, per aver scoperto all’Università di Stanford nel 1957 un enzima cellulare, detto DNA polimerasi, che lega fra loro le due eliche e che in natura svolge diverse funzioni comprese la replicazione e la riparazione del DNA. Questo enzima può allungare un corto oligonucleotide iniziatore o “ primer” aggiungendo un nucleotide per volta alla sua estremità 3’ (denominata così semplicemente per convenzione chimica) ma solo se il primer è ibridizzato o legato al filamento complementare detto filamento stampo o “template” . Il nucleotide attaccato è complementare alla base che si trova nella posizione corrispondente sul filamento stampo. Ad esempio se quest’ultima è una A, la polimerasi attacca una T ; se la base sul filamento è una G l’enzima attacca una C. Ripetendo questo processo, la polimerasi può estendere l’estremità 3’ del primer sino al termine 5’ dello stampo. In una doppia elica di DNA ciascun filamento serve da stampo all’altro durante la replicazione e la riparazione. La correzione degli errori avviene ad opera dell’attività 3’ esonucleasica della DNA polimerasi grazie alla quale l’enzima è in grado di riconoscere l’incorporazione di un nucleotide sbagliato , di eliminarlo e di formare un corretto appaiamento con il corrispondente nucleotide presente sullo stampo.
Una volta compresi i dettagli della struttura della doppia elica, rimaneva da decifrare il codice genetico: come venivano specificati, usando un alfabeto di sole quattro lettere, i venti amminoacidi di cui sono costituite tutte le proteine ?

Arthur Kornberg

A. Kornberg

Arthur Kornberg (1918–2007) biochimico statunitense, premio Nobel per la medicina nel 1959 assieme allo spagnolo Severo Ochoa per le sue scoperte sui meccanismi della sintesi biologica dell’acido deossiribonucleico. Il figlio Roger David Kornberg, è stato anche insignito di un premio Nobel, per la chimica nel 2006.

 

3 risposte a La scoperta della doppia elica del DNA

  • daniela scrive:

    il mio modo di rendere i dovuti onori alla Scienziata Rosalind, animata dal rigore della sperimentalista piuttosto che dalla sete di gloria che ha caratterizzato i suoi colleghi, è parlarne ogni anno scolastico con i miei alunni. Ottimo spunto per approfondimenti multidisciplinari!

  • Sara scrive:

    Bel sito, ma ingiusti contro la povera Rosalind.
    Hanno fatto bene a mettere la sua foto tra gli scopritori della doppia elica del DNA, anche se troppo tardi… 30 dopo la sua morte!

  • loide scrive:

    Watson si è comportato da…. e pure Wilkins, falsi.
    Sempre contro le donne! E’ questo il mio parere e non me ne vergogno per niente.
    Nessuno dei tre avrebbe dovu ricevere il premio Nobel… solo la bella e bravissima Rosalind Franklin!!!! 😀 😆 😆 😳 ❗ ❗ 😆 🙄

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