zona3
zona5-zona6

La ‘logica del vivente’ e la nascita della biologia molecolare

Print Friendly, PDF & Email

di Sergio Barocci

[  continua dalla 1° e dalla 2° parte:
Storia della scoperta degli acidi nucleici: prima della strutturistica di Watson e Crick
La scoperta della doppia elica del DNA”  ]

Kornberg e la scoperta della DNA polimerasi

La ricerca di un enzima che sintetizzasse il DNA fu iniziata da A. Kornberg e dai sui collaboratori nel 1956. Questa ricerca si dimostrò presto fruttuosa soprattutto perché vennero fatte tre scelte ispirate:

1.  Quali erano i precursori attivati del DNA ? Venne correttamente dedotto che i deossiribonucleotidi 5’ trifosfato erano gli intermedi attivati

2.  Quale era il criteri di sintesi del DNA ? Si riteneva che la quantità di DNA sintetizzato doveva essere piccola e che pertanto era essenziale un metodo di dosaggio molto sensibile per cui si utilizzarono come precursori dei nucleotidi radioattivi. L’incorporazione di questi precursori nel DNA era rivelata misurando la radioattività di un precipitato acido della miscela di incubazione. ( Il DNA viene precipitato dall’acido tricloacetico mentre i nucleotidi rimangono in soluzione)

3.  Quale specie di cellule si dovevano analizzare?

esprimento di Kornberg

esprimento di Kornberg

Si utilizzarono delle cellule batteriche dopo esperimenti iniziali di cellule di animali. Il batterio Escheria coli fu scelto in quanto possedeva un ampio tempo di replicazione di soli 20’ e poteva essere ottenuto in grande quantità e come ci si aspettò questo batterio rappresentava un’ottima fonte di enzimi che sintetizzavano il DNA
L’esprimento di Kornberg consistette in un estratto di E.coli che conteneva come enzima la DNA polimerasi che aggiunse ad una soluzione salina contenente molecole di DNA e quattro deossinucleotidi comprendenti timina marcata radioattivamente ( marcata con 14 C ) . Dopo incubazione a temperatura ambiente, la deossitimidina comparve in lunghi polinucleotidi, segnalando che la DNA polimerasi aveva funzionato generando nuovo DNA.
Ora questo enzima è chiamato DNA polimerasi I perché da allora sono state isolate diverse DNA polimerasi. La DNA Polimerasi I non è l’enzima principale della replicazione, il cui ruolo spetta alla DNA polimerasi III (nota per questo anche come replicasi). Essa svolge invece le seguenti funzioni :
a) funzione di riparazione dei danni del DNA, riempendo brevi regioni a singolo filamento;
b) ruolo accessorio durante la replicazione, consistente nel sostituire i ribonucleotidi (RNA) con deossiribonucleotidi (DNA), sul filamento lagging ( filamento ritardato : copia di DNA sintetizzata sullo stampo che ha direzione 5’→3’)

R. D. Kornberg

R. D. Kornberg

Roger David Kornberg (1947 – ) biochimico statunitense e premio Nobel per la chimica nel 2006 per lo studio sulle basi molecolari della trascrizione dei geni negli eucarioti.

Nel 1961 Sydney Brenner e Francis Crick scoprirono che inserire o eliminare una o due lettere nel DNA produceva un effetto devastante ma inserirne o eliminarne tre no e cosi capirono che nel primo caso si riscrivevano tutte le parole, mentre nel secondo se ne perdeva solo una: le parole del codice genetico, dette «codoni», erano dunque di tre lettere. E poiché con un alfabeto di quattro lettere si possono fare 64 codoni distinti, il codice doveva essere ridondante.

S. Brenner

S. Brenner

Sydney Brenner (1927 – ) biologo sudafricano esperto di codici, premio Nobel per la medicina nel 2002 per gli studi compiuti insieme a H. Robert Horvitz e John E. Sulston sulla regolazione genetica dello sviluppo degli organi e sulla morte cellulare programmata o apoptosi.

La dimostrazione che il codice genetico fosse basato su triplette di basi non sovrapposte, permise a Har Gobind Khorana, Robert Holley e Marshall Warren Nirenberg di decifrarlo.  Marshall Nirenberg scoprì, infatti, che uno dei più semplici segmenti di DNA, costituito di sole A (adenina) , produceva un particolare amminoacido (la fenilalanina): il codone corrispondente ( o “parola” fatta da nucleotidi) , dunque, doveva essere la tripletta di basi AAA e insieme a Gobind Khorana, che mise a punto tecniche chimiche per fabbricare segmenti di DNA consistenti di un solo codone e a Robert Holley per aver individuato la struttura del tRNA responsabile del trasporto dell’alanina ricevettero il Premio Nobel per la medicina nel 1968 per la loro interpretazione del codice genetico e della sua funzione nella sintesi proteica.  Queste scoperte sono alla base della moderna biologia molecolare.

Il passaggio dal DNA alle proteine non era però diretto, ma mediato da una seconda forma di acido nucleico, chiamata RNA.

Quindi è tra il periodo che andava dal 1961 al 1966 che venne decifrato il codice genetico, cioè venne stabilito il rapporto tra le 64 triplette possibili a partire dalle 4 basi nucleotidiche del DNA e i 20 aminoacidi che formavano le proteine.

struttura e parti caratteristiche dell'RNA transfer

struttura e parti caratteristiche dell’RNA transfer

Infatti, Crick nel 1958 nel proporre il dogma centrale della biologia molecolare in cui l’informazione genetica andava a senso unico, dal DNA all´RNA alle proteine. spiegò questo strano meccanismo, adducendo che l´uovo (il DNA) veniva necessariamente prima della gallina (le proteine), ipotizzando quindi che l’RNA si stata la prima molecola genetica, in un’epoca in cui la vita era basata solo su di essa mentre il DNA si sarebbe sviluppato successivamente , probabilmente in risposta all´instabilità dell’RNA.

Però, per scoprire il modo in cui le proteine venivano sintetizzate si dovette aspettare lo sviluppo di estratti crudi (cell-free), in grado di eseguire tutti i passaggi necessari per la sintesi. Grazie a questo metodo Paul C. Zamecnik (1912–2009) e collaboratori scoprirono che gli amminoacidi vengono uniti alle molecole che oggi chiamiamo RNA transfer (tRNA) da una classe di enzimi denominati amminoacilsintetasi, prima della loro incorporazione nelle proteine.

L’RNA transfer rappresenta circa il 10% di tutto l’RNA cellulare. Oggi si conosce che ogni tRNA si contiene una sequenza di basi adiacenti (l’anticodone) che si lega in maniera specifica a gruppi di basi contigue (codoni) lungo lo stampo di RNA durante la sintesi proteica. In ogni caso e, circa l’85% dell’RNA cellulare si trova nei ribosomi e dato che il loro numero aumenta notevolmente nelle cellule che hanno un’intensa attività di sintesi proteica, si pensò inizialmente che l’RNA ribosomiale (rRNA) fosse lo stampo per ordinare gli amminoacidi. Tuttavia, grazie all’utilizzo di cellule infettate con il fago T4, si scoprì che lo stampo per ordinare gli amminoacidi è l’RNA messaggero (mRNA), dato che trasporta l’informazione del DNA ai siti ribosomiali per la sintesi proteica.

S. B. Weiss

S. B. Weiss

Mentre si scopriva l’RNA messaggero, i biochimici Jerard Hurwitz (1928 – ) e Samuel B. Weiss isolarono in maniera indipendente il primo degli enzimi in grado di trascrivere l’RNA a partire da uno stampo di DNA. Questi enzimi, chiamati RNA polimerasi, funzionano solo in presenza di DNA, che funge da stampo su cui si formano le catene a singolo filamento di RNA. Nei batteri, lo stesso enzima produce ciascuna delle classi maggiori di RNA (ribosomiale, transfer e messaggero), usando appropriati segmenti di DNA cromosomico stampo.

Tom Cech

Tom Cech

Nel 1983 Tom Cech e Sidney Altman diedero la prima conferma che l’RNA era una sorta di «uovo-gallina» autocatalizzante, e ottennero il premio Nobel per la chimica nel 1989

Tom Cech (1947 – ) biochimico statunitense e premio Nobel per la chimica nel 1989. Il suo nome è legato principalmente a studi di biologia molecolare sulla trascrizione genica e sulle modificazioni che portano alla formazione, nel nucleo cellulare, di mRNA maturo a partire dal suo neosintetizzato precursore, in particolare sul meccanismo di splicing.

S. Altman

S. Altman

Sidney Altman (1939 – ) chimico statunitense di origine canadese, vincitore del Premio Nobel nel 1989 insieme a Thomas Cech, che arrivò allo stesso risultato pur non collaborando con Altman.

il codice geneticoUna volta compreso l’alfabeto e le parole del codice genetico, rimaneva da leggere l’intero libro: il genoma delle varie specie, uomo compreso. I capitoli del libro presero il nome di geni, e la scoperta di come si attivavano e si disattivavano in un batterio intestinale (E. coli) valsero il premio Nobel del 1965 a Jacques Monod e François Jacob: una coppia la cui popolarità rivaleggiava con quella di Watson e Crick, grazie anche ai loro rispettivi libri “ Il caso e la necessità” di J. Monod e “La logica del vivente “ ed. Einaudi, 1971 di F. Jacob.
Codice genetico degenerato ( si definisce degenerato in quanto più codoni possono codificare per uno stesso aminoacido. Le triplette che codificano lo stesso aminoacido presentano di solito le prime due posizioni conservate, mentre la terza varia.
Per quanto riguardava invece la separazione delle due eliche del DNA che Crick aveva supposto avvenisse come in una cerniera lampo, e stesse alla base del processo di copiatura dell’informazione genetica, vi fu la conferma finale dell’esperimento fondamentale di Matt Meselson e Frank Stahl per determinare il meccanismo semiconservativo di replicazione o duplicazione del DNA definito come il più bel esperimento della biologia.

codice genetico degenerato

Codice genetico degenerato: si definisce degenerato in quanto più codoni possono codificare per uno stesso aminoacido. Le triplette che codificano lo stesso aminoacido presentano di solito le prime due posizioni conservate, mentre la terza varia.

Jaques Monod - il caso e la necessitàIl caso e la necessità ed. Mondadori, 1970 di J. Monod : si tratta di un libro che ha suscitato nel mondo scientifico e filosofico il più vasto dibattito dopo l’origine della specie di C. Darwin. e che descrive le ultime scoperte della biologia molecolare e del DN. E’ un testo dedicato non solo ai biologi ma a tutti coloro che si interessano alle prospettive più originali della cultura moderna e ai rapporti delle scienze della vita con il pensiero filosofico.

Jacob - la logica del viventeLa logica del vivente ed. Einaudi, 1971.  In questo libro, F. Jacob mette ben in luce quale deve essere l’atteggiamento nuovo nei confronti dello studio della vita, la ricerca della sua logica. Fu proprio questo nuovo approccio teorico agli studi biologici che ha consentito al gruppo di ricercatori dell’Istituto Pasteur, agli inizi degli anni ‘60, di postulare l’esistenza di elementi fondamentali (RNA messaggero e i geni regolatori) che solo successivamente sarebbero stati isolati grazie all’utilizzazione di tecnologie più sofisticate.

 

 

L’esperimento di M. Meselson e F. Stahl

( Meselson M. Stahl FW . The replication of DNA in Escherichia Coli. PNAS U.S.A. 1958 Jul 15; 44(7): 671 – 682 )

Meselson e Stahl

Matthew Stanley Meselson (1930- ) biologo statunitense (a destra) e Franklin William Stahl (1929 -) biochimico statunitense (a sinistra) noti per l’esperimento fondamentale che li ha condotti a formulare il meccanismo semiconservativo di replicazione del DNA

Nel 1958 Matthew Meselson e Franklin W. Stahl realizzarono un esperimento fondamentale per dimostrare che il meccanismo della duplicazione del DNA era semiconservativo.

A quel tempo era già noto ed accettato il modello a doppia elica del DNA proposto da James Watson e Francis Crick. In questo modello si prevedeva che le due eliche di DNA si appaiassero tra loro a formare una doppia elica mediante interazioni deboli ( legami ad idrogeno, repulsione elettrostatica dei gruppi fosfato e interazione idrofobica delle basi azotate). Inoltre, poiché le due eliche interagivano a livello delle basi azotate, erano quindi possibili solo gli accoppiamenti complementari tra Adenina – Timina ( A-T) e tra Citosina – Guanina (C-G). Watson e Crick proposero senza però fornire alcuna dimostrazione che “ognuna delle due eliche contenesse l’informazione necessaria a costruire l’elica complementare”.

replicazione conservativa del DNA

replicazione conservativa del DNA

Ciò suggerì un sistema semplice ed efficiente per replicare il materiale genetico. Nel momento della replicazione le due eliche si sarebbero dovute separare ed ognuna di queste sarebbe servita da stampo per l’elica complementare. Si venne a parlare di replicazione semiconservativa , dal momento che nelle nuove doppie eliche uno dei due filamenti era presente nella doppia elica originale, l’altro era di nuova sintesi.

meccanismo di replicazione suggerito dal modello a doppia elicaSempre all’epoca dell’esperimento oltre al modello della replicazione semiconservativa furono proposti altri due meccanismi:

  1.  la replicazione conservativa ;
  2.  la replicazione dispersiva.

Il modello della replicazione conservativa prevedeva che a partire da una doppia elica di DNA, in seguito alla replicazione si sarebbero dovute formare due molecole: la prima contenente entrambi i filamenti originari e la seconda contenente due filamenti complementari di nuova sintesi, mentre nel modello della duplicazione semisconservativa, le due molecole figlie erediterebbero un solo filamento dalla molecola madre.

replicazione conservativa (a sinistra) e dispersiva (a destra)

replicazione conservativa (a sinistra) e dispersiva (a destra)

La replicazione dispersiva poteva invece essere immaginata come una via di mezzo rispetto a quella semiconservativa e a quella conservativa.

Meselson e Stahl pubblicarono i risultati del loro esperimento nel 1958 sulla Rivista PNAS fornendo una forte prova a favore della replicazione semiconservativa.  Fecero crescere per molte generazioni cellule batteriche di Escherichia Coli in un terreno di coltura in cui la sola fonte di azoto era costituita da 15NH4Cl (cloruro di ammonio) (isotopo pesante 15N).  Un “isotopo pesante” di azoto 15N contiene un neutrone in più rispetto all’isotopo presente in natura 14N, è più stabile rispetto agli altri isotopi radioattivi e le molecole che contengono 15N risultano essere più dense di quelle che contengono 14N.

possibili meccanismi di replicazione del DNA

possibili meccanismi di replicazione del DNA

Un altro aspetto interessante del successo dell’esperimento di Medelson e Stahl era rappresentato dal fatto che il DNA che conteneva 15N poteva essere distinto dal DNA che conteneva 14N. La procedura sperimentale comprendeva l’utilizzo di una tecnica nota come centrifugazione in gradiente di densità.  A tale scopo prelevarono alcuni batteri dalla coltura e ne estrassero il DNA che venne poi introdotto in una provetta contenente una soluzione di un metallo pesante come il cloruro di cesio (CsCl 6 M) . La provetta venne poi centrifugata.

centrifugazione in gradiente di densità

centrifugazione in gradiente di densità

Quindi, Meselson e Stahl, dopo aver inserito la provetta in centrifuga e dopo centrifugazione, poterono osservare una banda nella soluzione, contenente tutto il DNA estratto dai batteri.  La posizione della banda all’interno della provetta indicava il «peso» del DNA, che sarebbe stato più vicino al fondo se più pesante.
Dopo aver prodotto la loro coltura nel terreno con azoto pesante, i due scienziati estrassero il DNA da alcuni batteri, lo centrifugarono e videro che formava una banda vicino al fondo della provetta. A questo punto essi prelevarono dalla loro coltura alcuni batteri e li trasferirono in un nuovo terreno di coltura in cui era presente soltanto il comune azoto «leggero» (l’isotopo 14N) anziché azoto «pesante». Trascorso il tempo necessario per la formazione di una nuova generazione, prelevarono alcuni batteri da questa nuova coltura e ne estrassero il DNA. Dopo una centrifugazione in gradiente di densità, ottennero un’unica banda, posta in posizione superiore rispetto a quel la del caso precedente. Ciò voleva dire che il DNA dei batteri di questa nuova generazione era più leggero di quelli della generazione precedente. Dopo aver aspettato che si formasse un’ulteriore generazione di batteri, essi ripeterono l’estrazione del DNA. In questo caso, dopo la centrifugazione in gradiente di densità , ottennero due bande: una in posizione superiore a quelle dei due casi precedenti e l’altra nella stessa posizione di quella dell’esperimento precedente , in accordo con una duplicazione semiconservativa del DNA.

Riassumendo, i punti essenziali dell’esperimento furono i seguenti :

  1. Il DNA derivante dai batteri che erano stati fatti crescere su un terreno di coltura contenente 15N appariva come banda singola.
  2. Dopo un ciclo di replicazione il DNA appariva come banda singola, in posizione intermedia tra quella attesa per il DNA con 15N e quella attesa per il DNA con 14N.
  3. Dopo un secondo ciclo di replicazione il DNA appariva in forma di due bande, una nella posizione di DNA ibrido (metà con 15N e metà con 14N) e l’altra nella posizione del DNA che contiene solamente 14N.
esperimento di Meselson e Stahl

esperimento di Meselson e Stahl

Meselson e Stahl conclusero che l’azoto di una molecola di DNA si divideva in maniera uguale fra le due subunità fisicamente continue e che dopo la duplicazione, ciascuna molecola figlia riceveva una di queste subunità e che le subunità venivano conservate attraverso numerose duplicazioni. I loro risultati erano in perfetto accordo con il modello di Watson e Crick per la replicazione semiconservativa del DNA e hanno consentito di escludere sia la modalità conservativa sia quella dispersiva.

 

 

 

Gli esperimenti di Taylor,Woods e Hughes

Esperimenti di Taylor e collaboratori in Vicia faba: risultati riguardanti la replicazione del DNA cromosomico e loro interpretazione

Esperimenti di Taylor e collaboratori in Vicia faba: risultati riguardanti la replicazione del DNA cromosomico e loro interpretazione

Nel 1957, l’anno prima che fosse pubblicato il lavoro di Meselson e Stahl, J. Herbert Taylor e collaboratori , presentarono la prova che la replicazione semiconservativa avveniva anche negli organismi eucaristici. Essi, fecero degli esperimenti con gli apici radicali della fava (Vicia faba) che costituivano una fonte eccellente di cellule in divisione.  Furono in grado di monitorare il processo di replicazione marcando il DNA con 3H-timidina, un precursore radioattivo del DNA ed eseguirono una autoradiografia cioè una tecnica che quando veniva applicata a livello citologico era in grado di evidenziare la localizzazione di un radioisotopo in una cellula. Essi infatti trovarono timidina radioattiva solo in associazione con i cromatidi che contenevano DNA di nuova sintesi.

J. Herbert Taylor (1916-1998) Vicia faba in fiore ( pianta delle Leguminose)

Har Gobind Khorana (1922–2011) biochimico indiano naturalizzato statunitense. Nel 1968 le sue ricerche nella descrizione del codice genetico e sul suo ruolo nella sintesi proteica, gli valsero il premio Nobel per la medicina insieme a Marshall Warren Nirenberg e a Robert William Holley.

Marshall Warren Nirenberg (1927–2010) biochimico statunitense, noto per aver svelato il codice genetico e per averne interpretato il ruolo nella sintesi proteica. Questi studi gli valsero il Premio Nobel nel 1968 insieme a Robert Holley ed Har Gobind Khorana.

J. H. Taylor e Vicia faba

a sinistra: J. H. Taylor; a destra: pianta di Vicia faba

Robert William Holley (1922–1993) biochimico statunitense, noto per aver individuato la struttura del tRNA responsabile del trasporto dell’alanina ed aver contribuito, insieme a insieme a Marshall Nirenberg ed Har Gobind Khorana, a descrivere il meccanismo della sintesi proteica. Insieme a Nirenberg e Khorana, per tali ricerche, Holley vinse il Premio Nobel per la Medicina nel 1968.

Severo Ochoa de Albornoz (1905–1993) biochimico spagnolo naturalizzato statunitense nel 1956. Nel 1959 fu insignito assieme allo statunitense Arthur Kornberg del Premio Nobel per la medicina per le ricerche effettuate nella sintesi dell’ RNA.

biochimici statunistensi impegnati nella ricerca sul DNA

da sinistra a destra: H. G. Khorana, M. W. Nirenberg, R. W. Holley, S. O. de Albornoz

 

Riferimenti bibliografici

  1. J. Watson T. A. Baker, S. P. Bell, A. Gann, M. Levine, R. Losick . Biologia Molecolare del Gene VI Edizione – Zanichelli
  2. M. M. Cox, J. Doudna, M. O’Donnell – Biologia molecolare. Principi e tecniche – Zanichelli
  3. L. A. Allison Fondamenti di biologia molecolare- Zanichelli
  4. H. Kreuzer, A. Massey. Biologia molecolare e biotecnologie – Zanichelli
  5. https://it.wikipedia.org

 

 

2 risposte a La ‘logica del vivente’ e la nascita della biologia molecolare

Lascia un commento

Il tuo indirizzo email non sarà pubblicato. I campi obbligatori sono contrassegnati *

Sostieni la divulgazione della Chimica
Il tuo libero contributo sarà interamente devoluto alle attività di divulgazione della Chimica.
zona1




CONDIVIDI QUESTO ARTICOLO
RICHIEDI LA NEWSLETTER
Una mail settimanale con gli aggiornamenti delle pubblicazioni, le attività dell'Associazione e le novità del mondo della divulgazione chimica
SEGUI CHIMICARE ANCHE SU FACEBOOK
segui chimicare anche su facebook
ARTICOLI RECENTI
ARCHIVIO ARTICOLI PER MESE
SEGUI CHIMICARE ANCHE SU TWITTER
Non solo gli aggiornamenti degli articoli pubblicati sui nostri blog e le novità del Carnevale della Chimica, ma anche le segnalazioni dei migliori interventi di divulgazione chimica in lingua italiana nel web.