Kornberg

Dal sequenziamento del DNA alla scoperta della reazione polimerasica a catena

di Sergio Barocci

Le tappe storiche del sequenziamento di 1° generazione

A partire dagli anni ’70 del secolo scorso, incominciano a svilupparsi dei filoni di ricerca molto importanti, finalizzati al sequenziamento del DNA.  F. Sanger nel 1977 già premio Nobel per aver inventato il  sequenziamento delle proteine, sviluppa un nuovo ed efficiente metodo per sequenziare il DNA mediante interruzione controllata della sua replicazione.  Sempre nello stesso anno, contemporaneamente a F. Sanger, W. Gilbert e A. Maxam inventano un metodo analogo basato però su tagli specifici.  Nel 1978, poco dopo, viene messa a punto la tecnica dell’elettroforesi  utile per confrontare  frammenti diversi di DNA .
La conoscenza delle sequenze di DNA incomincia così a diventare  indispensabile per la ricerca biologica di base ma anche in numerosi campi  applicati come la  diagnostica, le biotecnologie , la  biologia forense , e la  biologia  sistematica .
sequenziamento del DNASequenziare  significa determinare il giusto ordine dei nucleotidi nella molecola del DNA.  Qualche volta,  il sequenziamento viene confuso con  la “decifrazione” del DNA  ma in realtà  è solo il primo passo in questa direzione, per quanto importante. Dopo avere eseguito il sequenziamento di   una molecola di DNA, occorre infatti   studiarla per capire cosa significhino le sequenze identificate.

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La ‘logica del vivente’ e la nascita della biologia molecolare

di Sergio Barocci

[  continua dalla 1° e dalla 2° parte:
Storia della scoperta degli acidi nucleici: prima della strutturistica di Watson e Crick
La scoperta della doppia elica del DNA”  ]

Kornberg e la scoperta della DNA polimerasi

La ricerca di un enzima che sintetizzasse il DNA fu iniziata da A. Kornberg e dai sui collaboratori nel 1956. Questa ricerca si dimostrò presto fruttuosa soprattutto perché vennero fatte tre scelte ispirate:

1.  Quali erano i precursori attivati del DNA ? Venne correttamente dedotto che i deossiribonucleotidi 5’ trifosfato erano gli intermedi attivati

2.  Quale era il criteri di sintesi del DNA ? Si riteneva che la quantità di DNA sintetizzato doveva essere piccola e che pertanto era essenziale un metodo di dosaggio molto sensibile per cui si utilizzarono come precursori dei nucleotidi radioattivi. L’incorporazione di questi precursori nel DNA era rivelata misurando la radioattività di un precipitato acido della miscela di incubazione. ( Il DNA viene precipitato dall’acido tricloacetico mentre i nucleotidi rimangono in soluzione)

3.  Quale specie di cellule si dovevano analizzare?

esprimento di Kornberg

esprimento di Kornberg

Si utilizzarono delle cellule batteriche dopo esperimenti iniziali di cellule di animali. Il batterio Escheria coli fu scelto in quanto possedeva un ampio tempo di replicazione di soli 20’ e poteva essere ottenuto in grande quantità e come ci si aspettò questo batterio rappresentava un’ottima fonte di enzimi che sintetizzavano il DNA
L’esprimento di Kornberg consistette in un estratto di E.coli che conteneva come enzima la DNA polimerasi che aggiunse ad una soluzione salina contenente molecole di DNA e quattro deossinucleotidi comprendenti timina marcata radioattivamente ( marcata con 14 C ) .

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La scoperta della doppia elica del DNA

di Sergio Barocci

[  continua dalla 1° parte:
Storia della scoperta degli acidi nucleici: prima della strutturistica di Watson e Crick”  ]

modello della struttura del DNA[…] Si arrivò così alla vigilia della scoperta della doppia elica del DNA: da sei anni Avery e collaboratori avevano pubblicato il loro classico lavoro in cui si dimostrava che il princìpio trasformante era il DNA . Insieme a scoperte successive , il lavoro di Avery e collaboratori ha costituito una prova sperimentale che il DNA e non le proteine rappresentava la molecola biologica dell’ereditarietà segnando l’inizio dell’era della biologia molecolare, anche se tale lavoro ebbe poco credito nella comunità scientifica di allora.
L’importanza del DNA nel meccanismo dell’ereditarietà divenne totale con l’esperimento del frullatore da parte di Alfred D. Hershey e di Martha Chase attraverso lo studio di batteri e batteriofagi. Tale esperimento a detta dello stesso Hershey, non rappresentava di certo l’esperimento migliore tra i tanti che consacrarono il DNA come la molecola portatrice dell’ereditarietà biologica.
Anche se era stato stabilito che il DNA era il materiale genetico di tutti gli organismi ad eccezione di alcuni virus e fornito alcuni dettagli su come alcuni componenti chimici di base costituivano gli acidi nucleici, rimaneva ancora da decifrare la struttura precisa del DNA cioè come venivano organizzate le catene polinucleotidiche in DNA che funzionava da materiale genetico.

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