I coenzimi ossidoriduttivi sono coenzimi che prendono parte a reazioni redox in processi biochimici.  I principali sono:

1.   Nicotinammide adenindinucleotide (NAD+/NADH,H+) (Fig.2)
2.   Nicotinammide adenindinucleotidefosfato (NADP+/NADPH,H+)
3.   Flavin adenina dinucleotide (FAD/FADH2)

NAD

Il NAD+ o nicotinammide adenin dinucleotide , è un coenzima presente in tutte viventi cellule.  E’ formato da due nucleotidi legati insieme tramite i loro gruppi fosforici in cui il nucleotide presenta la base azotata adenina mentre l’altro nucleotide presenta la nicotinammide (l’amimide dell’acido nicotico o niacina o Vitamina PP o Vitamina B3 (Fig.12).

Il coenzima NAD+ è stato scoperto dai biochimici britannici Arthur Harden e William Youndin nel 1906.  Essi avevano notato che l’aggiunta di bollito e lievito filtrato acceleravano la fermentazione alcolica in estratti di lievito non bollito.  Il fattore identificato e responsabile di questo effetto venne denominato coferment.  Attraverso una lunga e difficile purificazione da estratti di lievito, questo fattore termostabile venne identificato da Hans von Euler-Chelpin come nucleotide fosfato e nel 1936, Otto Heinrich Warburg dimostrò la funzione del coenzima nucleotide nelle reazioni Redox.

Fig. 12 – I due nucleotidi che costituiscono la molecola del NAD

Per esempio alcuni processi biochimici come la glicolisi o via di Embden – Meyerof (processo metabolico in condizioni di anaerobiosi dove una molecola di glucosio viene scissa in due molecole di acido piruvico al fine di generare molecole a più alta energia, come 2 molecole di ATP e 2 molecole di NADH per ogni molecola di glucosio utilizzata) o la - ossidazione degli acidi grassi ( processo metabolico che avviene nei mitocondri e che consente di degradare gli acidi grassi con produzione di acetil-CoA), il NAD + (ricevendo gli elettroni trasferiti dagli enzimi) si trasforma in NADH che successivamente trasferirà gli elettroni ossidandosi nuovamente a NAD +. Questo processo avviene in modo particolare durante la fosforilazione ossidativa per mezzo della catena respiratoria di trasporto degli elettroni che viene accoppiata alla produzione di ATP.

Come già riferito sopra il NAD è quindi un coenzima ossidoriduttivo. Infatti, sia il NAD+ che il suo analogo fosforilato NADP+ (sono le forme ossidate) possono essere ridotti a NADH e NADPH. Il NADP+ differisce dal NAD+ per la presenza di un gruppo fosfato sul carbonio 2 del riboso che porta l’adenina e ha diversi ruoli nel metabolismo (via dei pentosi fosfato o dello Shunt dell’Esosomonofosfato è un processo metabolico citoplasmatico, parallelo alla glicolisi, in grado di generare NADPH e zuccheri pentosi a 5 atomi di carbonio). Nel metabolismo, durante le reazioni Redox, un composto come il NAD può accettare o donare elettroni (e-).  In queste reazioni si ha la rimozione di due atomi di idrogeno dal reagente R nella forma di uno ione idruro H – e di un protone H + . Il protone viene poi rilasciato in soluzione mentre l’agente riducente RH2 viene ossidato e il NAD + in NADH ridotto dal trasferimento dello ione idruro all’anello della nicotinamide. Sulla nicotinamide è presente il sito di riduzione reversibile (il C4 dell’anello piridinico è il centro reattivo) e l’azoto N quaternario agisce come “trappola di elettroni”.

RH2 + NAD+ → NADH + H⁺ + R
Quando un composto si ossida, cede gli e^- ad uno che si riduce e il NAD è molto spesso colui che cede o acquista gli e- nelle reazioni biochimiche. L’addizione di uno ione idruro a un anello piridinico è alla base di molti processi riduttivi in ambiente biologico. E’ importante notare come i trasportatori di elettroni come NAD+, NADP+ , FMN e FAD partecipano alle Reazioni Redox trasferendo 2 elettroni alla volta.

ossidoriduzioni del NAD+ e del FAD

Il NAD+ e il NADH quando si legano ad una proteina enzimatica come in alcune deidrogenasi , si tengono all’interno di un motivo strutturale noto come “piega di Rossmann” o “Rossmann fold” (Fig.13).  Il motivo prende il nome da questo scienziato per essere stato il primo a notare quanto sia comune questa struttura all’interno di “nucleotide-binding proteins o “proteine che legano nucleotidi”.  Questo tipo di piegatura con due ripetizioni comprende sei filamenti beta paralleli legati a due coppie di alfa eliche in ordine topologico beta-alfa-beta-alfa-beta (βαβαβ).  Tuttavia, questa piega non è universale tra gli enzimi NAD-dipendenti.

Fig. 13 – Un tipico esempio di Rosmann fold

L’altro trasportatore di elettroni è il flavin adenin dinucleotide o FAD (Fig.14).  FAD e FADH2 sono le abbreviazioni usate per indicare la forma ossidata e la forma ridotta di questa molecola.  La parte reattiva del FAD è il sui anello isoallossazinico (Fig.14) e il FAD come il NAD può accettare 2 e^-.  Però, durante questa reazione a differenza del NAD+ acquista un protone e uno ione idruro.

FAD

Il FAD è un importante fattore ossidante del ciclo di Krebs.  Esso interviene nel trasporto degli elettroni nel processo biochimico chiamato “catena di trasporto degli elettroni “ È un coenzima ossidoriduttivo e partecipa a innumerevoli reazioni che comportano il trasferimento di elettroni. La molecola è costituita da tre anelli condensati che formano il cosiddetto il gruppo isoallosazinico della flavina, il quale è a sua volta legato al ribitolo (aldolo a cinque atomi di carbonio, ovvero il composto derivato dalla riduzione del ribosio) tramite l’atomo di azoto (N) dell’anello centrale. La molecola, se presenta il gruppo OH del carbonio in posizione 5, legato algruppo fosfato, prende il nome di Flavin Mono Nucleotide (FMN). Il gruppo fosfato, proviene dalla reazione della molecola con l’ATP, il quale libera un gruppo fosfato e forma così l’FMN. Se l’FMN, reagisce con un’altra molecola di ATP, quest’ultimo rilascia sia il nucleotide adeninico che il gruppo fosfato in α. Con questa reazione si forma il FAD. L’ultimo passo della produzione può essere anche il legame di un adenosin monofosfato con FMN. La forma ridotta della molecola FADH e FADH2 interviene in diverse reazioni biochimiche di trasporto degli elettroni e nella ossidazione degli acidi grassi.

Fig. 14 – Struttura della forma ossidata (FAD) e della forma ridotta (FADH2)

Infatti, gli atomi di idrogeno (H) possono essere uno o due, legati al gruppo isoallosazinico. Se all’anello c’è legato un solo atomo di idrogeno, allora prenderà il nome di FADH (radicale semichinonico).  Ques’atomo di idrogeno sarà legato all’azoto in posizione para sull’anello centrale del gruppo isoallosazinico ed il doppio legame presente nell’anello centrale scompare.  Se all’anello ci sono legati due atomi di idrogeno, allora prenderà il nome di FADH2. Questo secondo atomo di idrogeno sarà legato all’azoto in posizione para sull’anello terminale del gruppo isoallosazinico, ed il doppio legame presente nell’anello terminale scompare, formandosi invece un doppio legame tra l’anello centrale e quello terminale affinché le valenze dell’atomo di carbonio vengano rispettate.
Il NAD e il FAD sono dei coenzimi cioè dei non veri enzimi ma piuttosto delle molecole che aiutano altri enzimi . Se questi due coenzimi sono assenti , gli enzimi non funzionano più nel senso che viene persa la funzione di accettare e trasportare elettroni. Infatti, è grazie a questo processo che l’energia durante il catabolismo viene immagazzinata in modo controllato per le necessità cellulari.
Piridossalfosfato

Fig. 3 – struttura del piridossalfosfato o PALP

Il Piridossalfosfato (PALP) (Fig.3) è un coenzima utilizzato dalle amminotransferasi e dalle carbossilasi. La catalisi avviene in due passaggi: nel primo viene catalizzata, ad esempio, la deaminazione degli amminoacidi ad -chetoacidi. Nel secondo passaggio il gruppo amminico estratto viene trasferito ad un altro -chetoacido ( meccanismo a due substrati detto “ping-pong-bi-bi “, di Wallace W. Cleland), che diventa così un amminoacido. Il piridossalfosfato viene rigenerato in questo caso sullo stesso enzima, anche in questo caso in due passaggi. Le stesse considerazioni valgono anche per la reazione di decarbossilazione, che prevede l’idrolisi dell’intermedio legato all’enzima.

Meccanismi di reazione a due substrati
Le reazioni a due substrati sono quasi sempre reazioni di trasferimento e coinvolgono due substrati (A e B) e formano due prodotti (P e Q) rappresentano circa il 60% delle reazioni biochimiche conosciute:

A + B  <=(enzima)=> P + Q

Chiamate anche bisubstrato in quanto l’enzima catalizza lo spostamento di un gruppo funzionale specifico X, da uno dei substrati all’altro:

P–X  +  B   <=(enzima)=>   P  +  B–X

oppure reazioni di ossido riduzione, in cui vengono trasferiti equivalenti riducenti tra i due substrati.   Il trasferimento può avvenire:

1.   tramite un singolo spostamento : reazioni sequenziali o a singolo spostamento
2.   tramite un doppio spostamento: reazioni ping pong o a doppio spostamento
Reazioni sequenziali sono quelle reazioni in cui tutti i substrati si devono legare all’enzima prima che avvenga la trasformazione chimica e che i prodotti vengano rilasciati.

reazione enzimatica ping-pong a tre stati

Esse sono caratterizzate dal fatto che il gruppo che deve essere trasferito X viene spostato direttamente da A (=P—X) a B per formare P e Q (=B—X). Queste reazioni sono note anche come reazioni a singolo spostamento. Le reazioni sequenziali possono essere, inoltre, sottoclassificate sulla base dell’ordine di legame dei substrati all’enzima. Quelle che hanno un preciso ordine di ingresso dei substrati hanno un meccanismo ordinato mentre quelle che non presentano nessuna preferenza per l’ordine di legame dei substrati, possiedono un meccanismo casuale o random .
Nel meccanismo ordinato, il legame del primo substrato è apparentemente necessario per formare il sito di legame del secondo substrato, mentre nel meccanismo casuale o random , entrambi i siti di legame sono sempre presenti sull’enzima libero.

Meccanismo casuale o random:  si legano i due substrati e si staccano i due prodotti in vari ordini (come in molte chinasi e alcune deidrogenasi).

Meccanismo ordinato:  si legano i substrati S1 e S2 e si staccano i prodotti P1 e P2 in ordine (come in molte ossidoreduttasi NADP+ dipendenti).

Reazioni a ping pong:  sono meccanismi con cui uno o più prodotti vengono rilasciati prima che tutti i substrati si siano legati all’enzima.  In questo caso il gruppo X del primo substrato A (=P—X) viene rimosso dal substrato da parte dell’enzima E , si viene a formare il primo prodotto P e una forma enzimatica stabile F (= E—X) in cui X è saldamente legato (spesso covalentemente) all’enzima (fase ping). Nella seconda parte della reazione, X viene di nuovo spostato dall’enzima al secondo substrato B per formare il secondo prodotto Q (= B—X), rigenerando conseguentemente la forma originale dell’enzima E (fase pong). Queste reazioni sono pure chiamate reazioni a doppio spostamento (notare che in queste reazioni, i substrati A e B non si incontrano mai sulla superficie dell’enzima). Molti enzimi, come la chimotripsina, le aminotransferasi (transaminasi), le serin proteasi e alcune flavoproteine, reagiscono secondo questi meccanismi a ping pong.

schema di reazione di transaminazione

LE AMMINOTANSFERASI

Le amminotransferasi o transaminasi rappresentano una sotto-sottoclasse di enzimi (classe delle transferasi) che catalizzano la reazione di trasferimento del gruppo amminico α da un amminoacido a un α-chetoacido.
Le transaminasi più conosciute sono rappresentate da:
A)   glutammato-ossalacetato transaminasi, GOT, detta anche aspartato aminotransferasi, AST (Fig.15)
B)    glutammato-piruvato transaminasi, GPT, detta anche alanina aminotransferasi, ALT.

Fig. 15 – Struttura dell’ Aspartato transaminasi con Piridossalfosfato come cofattore

La reazione di transaminazione è la prima tappa del catabolismo degli amminoacidi e serve a inserire gruppi amminici verso l’ acido α-chetoglutarico al fine di trasformarlo in acido glutammico, il quale poi verrà sottoposto ad una reazione di deaminazione ossidativa (catalizzata dalla glutammato deidrogenasi) per formare uno ione ammonio che sarà successivamente utilizzato per generare l’ urea.
La reazione catalizzata dalle transaminasi è la seguente:

Amminoacido (1) + α-Chetoacido (1)     ⇔
⇔     α-Chetoacido (2) + Amminoacido (2)

Nelle cellule esistono molti tipi di transaminasi le quali utilizzano α-chetoglutarato come accettore del gruppo amminico ma divergono tra loro per la specificità nei confronti dell’amminoacido utilizzato.  Le reazioni catalizzate da tali enzimi sono tutte facilmente reversibili.
Tutte le transaminasi utilizzano lo stesso gruppo prostetico costrituito dal piridossal fosfato, che è la forma coenzimatica della vitamina B6, quale trasportatore temporaneo del gruppo amminico.  Il piridossal fosfato è legato covalentemente, tramite un legame imminico (con formazione di una base di Schiff dal nome del chimico Hugo Joseph Schiff che le scoprì), con il gruppo amminico ε di un residuo di lisina, in assenza del substrato (l’amminoacido).

Fig. 16 – Struttura generale di una base di Schiff dove R rappresenta una catena laterale organica

Quando arriva l’amminoacido il suo gruppo amminico α si sostituisce a quello ε della lisina.  La nuova base di Schiff ( Fig. 16) che si è creata rimane salda al sito attivo dell’enzima attraverso la formazione di legami multipli non covalenti.  Essa perde un protone dal carbonio α, formando un intermedio chinonoide, la cui riprotonazione determina la produzione di una chetimina che presenta un doppio legame tra il carbonio α e l’azoto del substrato legato.  Una successiva reazione di idrolisi determina il distacco di un α-chetoacido e la formazione di piridossammina fosfato.

Amminoacido (1) + Enzima-Piridossal fosfato    ⇔
⇔    α-Chetoacido (1) + Enzima-Piridossammina fosfato

La seconda parte della reazione si svolge in modo diametralmente opposto: un α-chetoacido si lega alla piridossammina fosfato e successivamente si stacca un nuovo amminoacido e si rigenera il piridossal fosfato.

α-Chetoacido (2) + Enzima-Piridossammina fosfato   ⇔
⇔    Amminoacido (2) + Enzima-Piridossal fosfato

COENZIMA A

Fig. 17 – Struttura generale di una molecola di acil-coenzima A dove R rappresenta una catena alifatica ad n termini

Il Coenzima A (CoA) (Fig.4) è un altro coenzima fondamentale per il metabolismo. Nel 1945 Lipmann trovò che in molte reazioni di acetilazione catalizzate da enzimi era necessario un fattore stabile al calore.  Questo cofattore fu chiamato Coenzima A dove la lettera “A” sta per acetilazione.  Il Coenzima A fu isolato e la sua struttura determinata molti anni dopo da Moffatt nel 1959. I gruppi acile si legano al Coenzima A con un legame tioestere e il composto che ne deriva prende il nome di acil-Coenzima A o acil-CoA (Fig.17)

Il CoA è un trasportatore di radicali acilici così come l’ATP è un trasportatore di radicali fosforici.
La funzione molecolare reattiva del CoA è il gruppo –SH della tioetanolammina, a livello del quale si formano legami ad alto potenziale energetico sia con radicali acetilici sia con altri radicali di acidi organici.

Fig. 18 – Struttura di acetil coenzima A

Il CoA sia in forma libera che acetilata è un metabolita essenziale dell’attività biochimica delle cellule.  La sua presenza è necessaria per lo svolgimento del ciclo di Krebs, per la sintesi e la demolizione degli acidi grassi e dei fosfatidi, per la sintesi del colesterolo, degli ormoni steroidi, delle porfirine. Tra i più importanti processi di acetilazione che avvengono nei tessuti con l’intervento del CoA si possono ricordare: la coniugazione della glicina con acido benzoico (sintesi ippurica); l’acetilazione detossicante delle ammine aromatiche ed eterocicliche esogene; l’acetilazione degli amminoacidi; l’acetilazione della colina, che porta alla sintesi del mediatore chimico della trasmissione nervosa, l’acetilcolina; l’acetilazione della glucosammina e della galattosammina, legate alla biosintesi della sostanza fondamentale del tessuto connettivo. A llo stesso modo, nel ciclo di Krebs ma anche nella glicolisi, hanno un ruolo anche i coenzimi FAD e NAD , prima di tutto come accettori di elettroni e poi come accettori di protoni o donatori di protoni.

COENZIMA Q

Il coenzima Q (nella sua forma Q10) o ubichinone è stato reso popolare per le sue proprietà rassodanti per la pelle dai produttori di cosmetici.  L’ubichinone è un trasportatore di elettroni che lavora nella catena di respirazione cellulare operando su diversi complessi proteici.
Fu identificato per la prima volta da Fred L. Crane e dal suo team dell’ Enzyme Institute dell’ Università del Wisconsin (Fig.19).  La struttura fu poi caratterizzata nel 1958 da D.E. Wolf e dal gruppo di ricerca di Karl Folkers nei laboratori della Merck.

CITOCROMI

I Citocromi sono proteine vettori di elettroni che permettono l’utilizzo dell’ossigeno a livello cellulare. Contengono il gruppo prostetico eme (Fig.8) e trasportano gli elettroni da un livello energetico alto ad uno più basso .

Fig. 20 – Rappresentazione dell’enzima CYP3A4, l’enzima maggiormente coinvolto nella degradazione dei farmaci

Questa liberazione energetica permette all’ATP-sintetasi di produrre molecole di ATP a partire da ADP e gruppo P. Sono suddivisi in quattro categorie principali a, b, c, d (Fig. 9) in relazione alla loro capacità di trasmettere alcune radiazioni dello spettro visibile che li fanno apparire colorati. Per ogni categoria si conoscono anche alcune sottocategorie come ad esempio a3, b5 e c1. Ogni differente specie possiede un diverso potenziale redox. Ad esempio, nei mitocondri ci sono tre classi di citocromi: citocromi a, citocromi b e citocromi c, tutti gli altri sono proteine integrali di membrana. Un’altra classe di citocromi fondamentali è costituita dal citocromo P 450, enzimi microsomiali epatici (codificati da geni indicati CYP) che hanno funzioni detossificanti verso sostanze tossiche in circolo sistemico e sono implicati nel metabolismo dei farmaci e di sostanze endogene come gli ormoni o prodotti nocivi del metabolismo. Di tutte le isoforme enzimatiche di citocromo P450 finora individuate, solo una piccola porzione comprendente gli enzimi CYP3A4, CYP2D6, CYP2C9, CYP1A2 e CYP2E1 agisce nel metabolismo dei farmaci. Fra queste l’isoforma più attiva è il CYP3A4 (Fig.20) , che costituisce circa il 30% dei citocromi P450 espressi nel fegato ed è responsabile del metabolismo del 50% dei farmaci attualmente esistenti.

BIOTINA

Fig. 10 – Struttura della biotina

La biotina (Fig. 10) svolge il ruolo di cofattore in diverse carbossilasi ATP-dipendenti , legandosi al sito attivo dell’enzima tramite un legame peptidico che si forma tra il gruppo carbossilico dell’acido valerianico ed un gruppo aminico di un residuo di lisina. La reazione di carbossilazione, in cui interviene la biotina, prevede il trasferimento di una molecola di CO2 da un donatore ad un accettore, passando per un intermedio in cui la biotina fissa la CO2 su uno degli atomi di azoto dell’anello imidazolico formando così la carbossibiotina. La formazione della carbossibiotina avviene tramite l’ausilio di bicarbonato, ioni magnesio ed ATP. Il bicarbonato, infatti, lega su di sé la CO2 tramite una reazione richiedente energia, fornita dall’idrolisi di una molecola ATP. La molecola di carbonilfosfato creatasi, cede poi CO2 alla biotina idrolizzando il gruppo fosfato.Negli esseri umani la biotina o Vitamina H viene utilizzata in molte reazioni di carbossilazione.

Bibliografia essenziale
1.   Kalckar HM . “50 years of biological research from oxidative phosphorylation to energy requiring transport regulation. 1991 Ann Rev Biochem 60:1-37
2.   Lipmann F. Wandering of a Biochemist . Wiley Interscience 1971.
3.   Passarella S. Elementi di enzimologia. Guida allo studio. Ed. Aracne 2011.
4.   Siliprandi e Tettamanti “Biochimica Medica” Ed. Piccin

struttura tridimensionale dell’emoglobina: in rosso il gruppo prostetico eme

Gli enzimi, i catalizzatori biologici della materia vivente, sono delle molecole proteiche grazie alle quali le reazioni chimiche avvengono ad una velocità tale da consentire la vita, cioè, essi rappresentano dei semafori che regolano il traffico di metaboliti lungo le vie metaboliche, la cui attività può rispondere alle diverse esigenze metaboliche.  Molte volte l’azione degli enzimi deve essere coadiuvata o integrata da quelle di altre molecole complesse o cofattori.
In enzimologia con il termine di cofattore si intende una piccola molecola di natura non proteica o anche uno ione metallico che ha il compito di associarsi all’enzima e di renderne possibile l’attività catalitica.  I cofattori, non essendo proteici, spesso devono essere assunti con la dieta, perché non possono essere prodotti dalla cellula.  Per questo motivo, storicamente, spesso ci siamo riferiti ai cofattori come a vitamine, cioè elementi necessari per il metabolismo da assumere attraverso l’alimentazione.  Esistono, in ogni caso, numerosi cofattori non-vitaminici, come ad esempio i gruppi eme (contenuti in proteine come l’emoglobina) e diversi ioni metallici.
Sulla base della loro natura chimica, i cofattori vengono quindi suddivisi in metalli e coenzimi (intesi come piccole molecole organiche).   Un enzima privo del cofattore che ne rende possibile l’attività enzimatica è detto apoenzima.  Il legame tra cofattore ed apoenzima permette la formazione del cosiddetto oloenzima (detto anche oloproteina).
In base all’interazione con l’enzima , i coenzimi, come anche alcuni cofattori metallici, possono legarsi all’enzima tramite legami covalenti oppure attraverso legami deboli.
Se legati in modo stabile, essi vengono chiamati gruppi prostetici se invece legati in maniera debole, si parla di cosubstrati, dal momento che in questo caso essi si legano all’enzima solo in occasione della catalisi della reazione, proprio come avviene per un substrato.

Fig. 1 – Struttura ATP (a sinistra) ed ADP (a destra)

Pertanto, i coenzimi partecipano alla reazione enzimatica e dopo la reazione vengono riconvertiti nella forma originale.

I principali cosubstrati sono:
1.  l’ATP o adenosina trifosfato (coinvolto in reazioni di fosforilazione) (Fig.1);
2.  l’ADP o adenosina difosfato (accettore di gruppi fosfato) (Fig.1);
3.  il NAD+ ed il NADP+ (accettori di elettroni e protoni, in reazioni di ossidazione) (Fig.2);
4.  il NADH/H+ ed il NADPH/H+ (donatori di elettroni e protoni, in reazioni di riduzione);
5.  il piridossalfosfato (PALP) (cofattore delle amminotransferasi);
6.  Coenzima A (trasportatore di gruppi acilici) (Fig.4);
7.  Coenzima Q (partecipa alle reazioni Redox)

Fig. 2 – Struttura del NAD+ o Nicotinamide adenina dinucleotide e del NADP+ o Nicotinamide adenina dinucleotide fosfato

Tutte queste molecole sono costituite per lo più da un nucleotide da solo oppure associato a vitamine o a parti di queste ed il loro intervento è essenziale nelle reazioni che comportano variazioni energetiche.  I nucleotidi sono composti ricchi di energia; rappresentano dei segnali chimici di risposta a stimoli extracellulari e sono inoltre anche componenti degli acidi nucleici.
Il nucleotide (Fig.3 ) è una molecola in cui si possono riconoscere tre porzioni: una base azotata, uno zucchero, un gruppo fosforico.   Si differenzia per il tipo di zucchero, D-ribosio o 2′-deossi-D-ribosio e per la base azotata, (purinica o pirimidinica).
I nucleotidi sono in grado di svolgere numerose funzioni cellulari oltre al loro ruolo di subunità costituenti degli acidi nucleici.  Infatti possono essere adoperati dalla cellula come:
a)  trasportatori di energia chimica;
b)  componenti di cofattori enzimatici;
c) messaggeri chimici come AMP Ciclico (cAMP) GMP Ciclico (cGMP) caratterizzati dalla presenza di un legame 3’, 5’ e che si formano a partire da ATP o GTP ad opera di specifici enzimi (adenilato cilasi e guanilato ciclasi)

COSUBSTRATI NUCLEOTIDIDI NEL TRASPORTO DELL’ENERGIA CHIMICA

I nucleotidi sono composti ricchi di energia :
    Legame ribosio → P legame estereo (14 KJ/mol)
    Legame Pα → Pβ legame anidridico (30 KJ/mol)
    Legame Pβ → Pγ legame anidridico (30 KJ/mol)
Infatti, possono legare gruppi fosforici addizionali legati al gruppo fosforico presente sul carbonio 5′ del ribosio. Si parla così di nucleosidi mono, di e tri-fosfato. I tre gruppi fosforici sono indicati con le lettere α, β e γ. Il gruppo fosforico α è legato al ribosio con un legame estereo.  I legami tra α β e tra β γ sono anidridici . L’idrolisi dei nucleosidi trifosfato rappresenta una importante fonte di energia chimica per la cellula. L’energia rilasciata dall’idrolisi dipende, tuttavia dal legame in cui il gruppo fosforico è coinvolto.  L’idrolisi dei legami anidridici fornisce una quantità di energia maggiore dell’idrolisi del legame estereo.

Fig. 6 – Formule generali rispettivamente di nucleotide mono-, di- e trifosfato

Nella struttura di alcuni coenzimi (Coenzima A, NAD+ e FAD +) è presente un nucleotide adenilico. Il nucleotide adenilico non partecipa alla reazione enzimatica ma:

• aiuta a posizionare il substrato nella tasca del sito attivo,
• stabilizza il complesso enzima/substrato,
• è coinvolto nel legame del coenzima all’enzima.

Con il termine di gruppo prostetico s’intedono invece quelle molecole non proteiche strettamente legate ad una proteina (spesso un enzima), attraverso un legame covalente (coenzimi) o un legame di coordinazione (gruppo eme) , da cui non si distaccano né durante il corso della reazione, né ad enzima inattivo.  I principali gruppi prostetici sono rappresentati da:

1.    il gruppo eme dell’emoglobina (Fig. 8) o meglio dei citocromi (Fig.9) (non essendo l’emoglobina normalmente considerata un enzima) sono cofattori non-vitaminici;
2.   la biotina nelle carbossilasi (Fig.10);
3.   il FAD/FADH e FADH2 (Fig.11)

Fig. 9 – Struttura tridimensionale citocromo C

I Citocromi ( Fig. 9) come l’emoglobina sono un tipico esempio di proteine aventi come gruppo prostetico il gruppo eme (Fig.8 ) o coenzima il cui atomo di Fe (III) va incontro a riduzioni mono elettroniche reversibli.  Un enzima privo del cofattore che ne rende possibile l’attività enzimatica è detto apoenzima.  Il legame del coenzima alla corrispondente frazione proteica o apoenzima, è condizione indispensabile affinché l’enzima possa svolgere la propria attività catalitica o oloenzima.

APOENZIMA(solo proteina, inattiva) + COFATTORE  ==> OLOENZIMA(attivo)

Nella maggior parte dei casi è il coenzima a determinare il carattere della reazione chimica enzimatica, mentre all’apoenzima è dovuta la specificità della reazione stessa.
Le modalità con cui i coenzimi intervengono nei processi enzimatici sono molteplici: essi possono distaccarsi dalla parte proteica ed essere trasferiti al substrato con cui variamente reagiscono, oppure cedere al substrato solo un frammento della propria struttura.
In altri casi l’enzima conserva la sua integrità limitandosi a favorire il trasferimento di gruppi chimici, di ioni o di cariche elettriche da un composto donatore al substrato accettore. Talvolta la classificazione dei coenzimi viene effettuata sulla base di criteri funzionali, cioè con riferimento all’attività degli enzimi corrispondenti.

Fig. 11 – Formula del FAD ridotto (FADH2)

Si hanno così: coenzimi deputati al trasporto di ioni idrogeno (coenzimi flavinici come flavina mononucleotide o FMN/FMNH2 e flavin adenina dinucleotide o FAD/FADH2); oppure al trasporto di elettroni (metallo-porfirine quali i coenzimi delle catalasi, delle perossidasi, i citocromi); coenzimi che permettono il trasferimento al substrato sia di elettroni sia di ioni idrogeno, come per esempio i coenzimi delle deidrogenasi (Fig.12) il nicotinammide adenin dinucleotide o NAD+/NADH,H+ e il nicotinammide adenin dinucleotide fosfato o NADP+/NADPH,H+).
Altri coenzimi intervengono nei processi metabolici di decarbossilazione (tiaminfosfato o TPP , piridossalfosfato o PALP) oppure nel trasferimento di radicali fosforici (ATP), acilici (Coenzima A), solforici (fosfoadenosinfosfosolfato o PAPS), di zuccheri monosaccaridi (UDP), della colina (colina-fosfato), ecc.
Va sottolineato che l’attività biologica di numerose vitamine deriva dalla loro natura di coenzima o di metaboliti precursori di coenzimi.  In altre parole i coenzimi sono vitamine modificate chimicamente.

UN ESEMPIO EMBLEMATICO: IL CASO DELL’ADP/ATP

L’ATP o adenosina trifosfato è la moneta corrente per tutte le attività cellulari che producono o consumano energia.  L’ATP viene prodotto nel catabolismo ossidativo e viene speso nelle reazioni biosintetiche o nelle attività cellulari come trasporto di metaboliti e ioni attraverso la membrana, oppure nella contrazione muscolare, nella produzione di calore.
L’ATP rappresenta l’energia “ disponibile ” per tutte le esigenze energetiche della cellula.
L’ATP (Fig.1) è costituita da una molecola di adenina ed una di ribosio a cui sono legati tre gruppi fosforici a β e γ mediante legami ad alta energia.

Vi sono due modi per produrre ATP attraverso le reazioni del catabolismo ossidativo:

a)   Reazioni di fosforilazione a livello del substrato.
In questo tipo di reazioni che sono catalizzate da delle cinasi, un intermedio metabolico fosforilato cede il fosfato all’ADP con formazione di ATP secondo il seguente schema generale:
XP + ADP → X + ATP
Esempio: 1,3 bisfosfoglicerato e fosfoenolpiruvato nella glicolisi; creatina fosfato (“riserva di ATP” nel muscolo).  Il potenziale di trasferimento del fosfato di questi composti fosforilati è maggiore di quello dell’ATP.

mitocondrio e sua struttura interna

b)   Fosforilazione ossidativa.
Nel processo della fosforilazione ossidativa (che avviene nei mitocondri) l’energia “potenziale” dei coenzimi ridotti (NADH e FADH2) è trasformata nell’energia “pronta” dell’ATP attraverso un complesso meccanismo.  I coenzimi ridotti sono stati prodotti in reazioni di ossidazione dei substrati (glucoso, fruttoso, acidi grassi) nelle varie vie metaboliche del catabolismo (glicolisi, ciclo di Krebs, ossidazione degli acidi grassi).

Pertanto il processo di produzione dell’ATP via fosforilazione ossidativa si può dividere in 2 fasi:
Fase 1 : riduzione dei coenzimi nelle reazioni di ossidazione dei substrati metabolici
Xrid + NAD/FAD → Xoss + NADH/FADH2
Fase 2 : ri-ossidazione dei coenzimi ridotti accoppiata alla produzione di ATP nella fosforilazione ossidativa nei mitocondri
NADH/FADH2 + O2 → NAD/FAD + H2O
ADP + Pi → ATP + H2O

La fosforilazione ossidativa è la principale fonte di ATP per la maggior parte delle cellule del nostro organismo ( per maggiori dettagli visionare l’articolo “ Enzimi e Vitamine nel mantenimento dell’equilibrio redox della cellula” di N. Ticchi )

I PERSONAGGI CHE HANNO FATTO LA STORIA DELL’ENZIMOLOGIA

Herman Moritz Kalckar

Herman Moritz Kalckar (1908-1991) è stato un biochimico danese che ha aperto la strada allo studio della respirazione cellulare. Egli diede un significativo contributo allo sviluppo delle biochimica nel XX secolo biochimica specialmente nell’enzimologia. Infatti, evidenziò il ruolo di composti “ad alta energia” nei processi metabolici sviluppando il ruolo centrale dell’ adenosina-5′-trifosfato (ATP) come comune metabolico “vettore energetico”. Fritz Lipmann, pubblicò in uno studio analogo il concetto di “~ P” come mezzo per rappresentare un legame ad “alta energia”.

Fritz Albert Lipmann

Fritz Albert Lipmann ( 1899 – 1986) biochimico tedesco – statunitense co-scopritore nel 1945 del coenzima A.
Per tale motivo, insieme ad altre ricerche sul coenzima A , venne insignito del Premio Nobel per la Fisiologia e la Medicina nel 1953 insieme ad Hans Adolf Krebs . Dopo essersi laureato in medicina nel 1924 a Berlino e trascorso un breve periodo a Koenigsberg per studiare chimica presso il professor Hans Meerwein, nel 1926 divenne assistente di Otto Meyerhof nel laboratorio del Kaiser Wilhelm Institute di Berlino e successivamente a Heidelberg sempre con Meyerhof per ulteriori ricerche sulle reazioni biochimiche muscolari. Nel 1930 ritornò al Kaiser Wilhelm Institut di Berlino come assistente di ricerca presso il laboratorio di Albert Fischer, e poi nel 1932 sempre con Fisher nel nuovo Istituto biologico della Fondazione Carlsberg di Copenhagen dove condusse delle indagini sul meccanismo di ossidazione dell’acido piruvico, Tra il 1931 e il 1932, lavorò, inoltre, come fellow presso la Rockefeller Institute di New York, dove identificò una serina fosfato quale componente di fosfoproteine contenenti fosfato.

Otto Fritz Meyerhof

Nel 1939 Lipmann divenne ricercatore associato presso il Dipartimento di Biochimica alla Cornell Medical School di New York, e nel 1941 entrò nel personale di ricerca del Massachusetts General Hospital di Boston, prima come ricercatore associato nel Dipartimento di Chirurgia, poi come responsabile nel Laboratorio Biochimico dell’ospedale. Nel 1949 divenne professore di Chimica Biologica presso la Harvard Medical School di Boston e nel 1957 nominato membro e professore della Rockefeller Institute di New York. Durante la fine degli anni ’40 e i primi anni ’50 , si interessò del coenzima A e di altri derivati del fosfato apparentemente inusuali che sorgevano nei processi di attivazione attraverso il trasferimento di P da ATP e in seguito ad alcune osservazioni sulla fosforolisi della citrullina, concentrò la sua attenzione sul CMP , un donatore di P metabolicamente attivo.

Archibald Vivian Hill

Il sospetto si rivelò giustificato , perché in collaborazione con Mary Ellen Jones (1922 – 1996) (alla quale si deve la scoperta carbamoilfosfato , una sostanza chimica che è la chiave per la biosintesi di arginina e di urea e le basi scientifiche per la ricerca sul cancro) e con Leonard Spector, giunse alla scoperta di un metodo inaspettatamente semplice di sintesi chimica di CMP. Con H. Hilz e P.W. Robbins sempre in questo settore individuò l’esistenza di una nuova classe di composti chimici come adenosina-5′-phosphosulphate (APS) e 3′-phosphoadenosine-5′-phosphosulphate (PAT) identificati come solfati «attivi» solfati. Lipmann è stato anche membro di numerose società scientifiche negli Stati Uniti. Morì nel 1986 a New York.

Arthur Harden

Otto Fritz Meyerhof (1884 – 1951) biochimico tedesco insignito del Premio Nobel per la Medicina , insieme a Archibald Vivian Hill nel 1922 per il lavoro sul metabolismo muscolare, tra cui la glicolisi.

Archibald Vivian Hill (1886 – 1977) fisiologo inglese. Premio Nobel nel 1922 per la spiegazione della produzione di calore e del lavoro meccanico nel tessuto muscolare.

Arthur Harden  (1865 –  1940  )   biochimico inglese  vincitore del  Premio Nobel per la Chimica nel 1929 insieme a  Hans Karl August Simon Von Euler-Chelpin per le loro indagini sulla fermentazione  degli  zuccheri e sugli  enzimi .

Karl August Folkers

Karl August Folkers (1906-1997) è stato uno dei chimici organici più fantasiosi nel campo della chimica biologica nel secolo scorso. La maggior parte dei suoi contributi più importanti sono state fatte durante il periodo in cui egli ha lavorato presso la Società Merck a Rahway nel New Jersey, a partire dal 1934. Il suo Laboratorio divenne un centro per la purificazione, la determinazione strutturale e la sintesi di un gran numero di fattori, tra cui la vitamina B-6 (piridossina, piridossale e piridossamina), acido pantotenico, biotina, vitamina B-12, acido mevalonico e ubichinone (coenzima Q).

Otto Heinrich Warburg

Otto Heinrich Warburg (1883 –  1970).  Fisiologo tedesco, premio Nobel per la medicina nel 1931 per le sue fondamentali ricerche nel campo della fisiologia cellulare. Fu uno dei maestri di Hans Adolf Krebs.

Wallace W Cleland

Wallace W. Cleland (1930 –  2013) pioniere nello studio cinetico e meccanicistico di enzimi che utilizzano più di un substrato. 

La sede dell’Enzyme Institute a Madison – Università del Winsconsin

Alcuni atomi, inseriti in un campo magnetico e sottoposti a irraggiamento con onde radio, sono in grado di emettere segnali che ci forniscono preziose indicazioni sul loro intorno chimico e, in definitiva, sulla molecola cui appartengono.  Fa differenza quindi, se di fianco ad un carbonio o ad un idrogeno troviamo un ossigeno, un benzene o un altro atomo?  Assolutamente sì, ed è proprio tale differenza che ci permette di capire cosa ci troviamo di fronte.

schema di un NMR

Abbiamo visto nel precedente articolo [Introduzione all'NMR: come dialogano atomi e magneti] come questa tecnica sia preziosa per studiare la struttura di una molecola, per capire come sono legati tra loro gli atomi e per discriminare tra specie apparentemente molto simili.  Il chimico organico utilizza quotidianamente l’NMR; come già detto, ciò gli consente di dare un volto a ciò che ha ottenuto da una reazione o da una purificazione di matrici di vario genere.  Ma non è tutto.  Il quadro delle possibili applicazioni di questa tecnica è variegato e variopinto, con una considerevole flessibilità che permette di esplorare la scienza in tutte le sue espressioni.  Vedremo di seguito alcuni tra gli utilizzi più consolidati e frequenti, che coprono un ampia gamma di ambiti, dalla medicina all’agro-alimentare.

Medicina e dintorni: un macro-esperimento

Se pensiamo che le molecole più semplici, naturali o sintetiche che siano (non c’è tutta questa differenza, l’NMR lo dimostra), possono organizzarsi e dare a vita a strutture via via più complesse fino ad arrivare a macro-strutture, organi e apparati, possiamo facilmente immaginare che la possibilità di studiare la struttura tramite NMR possa essere estesa anche a questo tipo di sistemi.  Proprio così.  D’altronde, in medicina la risonanza magnetica è ormai tra le tecniche diagnostiche più diffuse, non a caso, proprio per ottenere informazioni sullo stato degli organi all’interno del nostro organismo.  Con questa tecnica è infatti possibile “fotografare” l’interno del nostro corpo, limitatamente all’area di nostro interesse, e riscontrare eventuali anomalie nella forma dell’organo.  Molto utilizzata e gettonata, questa tecnica non invasiva rappresenta un fiore all’occhiello nel progresso tecnologico in ambito medico: fornisce immagini dettagliate del corpo umano e, grazie a ciò, molte patologie e alterazioni a carico degli organi interni possono essere visualizzate e facilmente diagnosticate.  Come funziona?
Facciamo un piccolo passo indietro e cerchiamo di capire quale differenza c’è tra risonanza magnetica e lastre con irradiazione da raggi X, altra tecnica estremamente comune in diagnostica.  Se vi ricordate il campione da analizzare viene inserito, opportunamente diluito in adatto solvente, nello spettrometro e alloggiato all’interno di un magnete, rappresentato sempre più spesso da una bobina di un materiale superconduttore.  Qui, sottoposto a campo magnetico e ad irraggiamento, emetterà una certa quantità di energia che, raccolta da un rivelatore ed elaborata a dovere, darà origine ad un segnale a noi utile per lo studio strutturale.  La stessa cosa avviene, con le dovute proporzioni, al paziente che si sottopone ad una RM.   Il paziente, infatti, viene introdotto all’interno della macchina, costituita da un tubo abbastanza largo e non troppo stretto, aperto alle due estremità, dotato di apparecchiature accessorie, dove viene irradiato da un campo magnetico ad elevata intensità.   All’interno della macchina, le forze generate nel campo magnetico fanno sì che i momenti magnetici dei singoli atomi che compongono l’organismo, o la parte di esso coinvolta, si allineino con la direzione del campo indotto, inducendo temporanee alterazioni dei nuclei che, una volta interrotte le onde radio, tornano alla normalità generando segnali.  Questi vengono trasmessi ad un computer e trasformati in immagini tridimensionali, nelle quali i tessuti presentano colorazioni differenti: sono infatti di colore chiaro se ricchi di acqua, grazie all’abbondante presenza di atomi di idrogeno e scuri se ne sono poveri.  In alcuni casi, in relazione al tipo di patologia da studiare e alle circostanze specifiche, viene somministrato al paziente un mezzo di contrasto per via endovenosa: non è altro che una sostanza in grado di visualizzare in modo migliore una determinata regione da analizzare.  In particolare, alterando il contrasto di un organo o di qualsiasi altra struttura rispetto a ciò che la circonda, è possibile rendere visibili dettagli altrimenti non apprezzabili.  Nella RM i parametri che influenzano il segnale sono legati non solo alla densità ma soprattutto al rilassamento protonico, fattore che ha reso possibile sviluppare prodotti in grado di incrementare sensibilmente il contrasto tra tessuto normale e tessuto patologico anche a bassissima concentrazione.  Infatti mentre i mezzi di contrasto (generalmente organo-iodato) utilizzati in tomografia computerizzata, meglio conosciuta come TAC, bloccano direttamente i fotoni che attraversano l’organo bersaglio, in RM i mezzi di contrasto influenzano i tempi di rilassamento T1 e T2 dei protoni disposti in loro adiacenza, in modo tale che una singola molecola di mezzo di contrasto esplichi la sua azione su un numero elevatissimo di protoni a concentrazioni nettamente inferiori a quelle necessarie in diagnostica TC.  I mezzi di contrasto in RM sono costituiti da atomi o molecole in grado sia di incrementare il segnale sia di abbassarlo; tale effetto è ottenuto modificando localmente le proprietà del campo magnetico tramite sostanze con proprietà ferromagnetiche, paramagnetiche o diamagnetiche.  Si tratta di sostanze che possiedono la capacità di orientarsi nella direzione del campo magnetico o sono in grado di acquisire tale capacità in determinate situazioni.

immagini da TAC con mezzi di contrasto per l’encefalo

Fra i mezzi di contrasto più utilizzati vi sono il gadolinio (elemento chimico con numero atomico 64), per le caratteristiche paramagnetiche del suo ione Gd³⁺, che viene usato in soluzione e complessato da leganti ciclici onde evitare la tossicità dello ione libero; il suo utilizzo è preferenziale come mezzo di contrasto extracellulare o per valutare l’integrità della barriera ematoencefalica.  Vi è poi l’ossido di ferro, le cui particelle sono selettivamente captate dal sistema reticolo-endoteliale, quindi da fegato, midollo osseo e milza; anche l’emoglobina, naturalmente presente nel nostro corpo, in quanto coinvolta nel trasporto dell’ossigeno e dell’anidride carbonica nel sangue, può agire da agente di contrasto e proprio la sua azione gioca a nostro favore.  Infatti, dato che le sue proprietà magnetiche variano a seconda del grado di ossigenazione della molecola, questa proprietà viene sfruttata per visualizzare le aree di tessuto ossigenate o meno, rivestendo una grande importanza principalmente nella risonanza magnetica funzionale.
Come abbiamo avuto modo di intuire quindi, con la RM sono ben visibili i tessuti molli ed è possibile la discriminazione tra tipologie di tessuti, talora non apprezzabile con altre tecniche radiologiche; a questo proposito, la Risonanza Magnetica può essere usata per la diagnosi di una grande varietà di condizioni patologiche che vede coinvolti gli organi e i tessuti del corpo.  E’ particolarmente utile per lo studio dei tessuti ricchi di acqua e quindi di atomi di idrogeno, meno per l’esame delle strutture anatomiche ‘dure’, quindi carenti di acqua come le ossa.  Risulta vincente, per esempio, nella diagnosi delle malattie del cervello e della colonna vertebrale, degli organi dell’addome, dei vasi sanguigni principali e del sistema muscolo-scheletrico.  La presenza di acqua, quindi in definitiva di idrogeno, è fondamentale ai fini della rilevanza di tale tecnica.
Ora che abbiamo capito come viene svolta una risonanza magnetica e su quali principi si basa sicuramente ci farà meno paura.  E se possiamo studiare e “scansionare” i nostri organi purché siano ricchi di acqua, perché non applicare la stessa tecnica anche alle cellule, che non mancano certo di fluido al loro interno?

Studi in vivo e metabolomica: una tecnica non invasiva

Un vantaggio inestimabile dell’impiego della spettroscopia di risonanza magnetica nucleare NMR nello studio delle cellule è proprio la non invasività e, di conseguenza, il fatto che non si verifichi una perturbazione dell’ambiente cellulare.  Con questa tecnica è possibile compiere sofisticati studi nei sistemi cellulari in condizioni simili a quelle naturali, con l’opportunità di poter osservare gran parte delle reazioni che avvengono all’interno delle cellule viventi.  Non a caso i nuclei più studiati come C, N, P e H costituiscono gli elementi fondamentali di tutte le molecole presenti nel nostro organismo!  Pensiamo ad una delle reazioni più importanti, che avviene in continuo nel nostro organismo, in ogni singola cellula ad un ritmo iper-sostenuto: la respirazione cellulare, con conseguente produzione di energia sottoforma di ATP.  Il fosforo, indicato come ³¹P, presente in composti molto importanti per il metabolismo della cellula, quali appunto ATP, ADP, esteri fosforici e fosfato inorganico, dà origine a segnali notevolmente intensi, che permettono di seguire la concentrazione di questi composti in cellule viventi ma anche in tessuti ed in vivo.  La presenza di fosfato inorganico, che si genera per idrolisi dei composti fosforati ad alta energia, ci fornisce una serie di importanti informazioni: ad esempio, lo ione PO₄^3- è protonato in modo diverso in funzione del pH e ai valori normalmente presenti nella cellula predominano le specie H₂PO₄^- e HPO₄^2-.
Cosa rende possibile il loro studio in NMR?   Il fatto che tali specie sono caratterizzate da un diverso chemical shift.  Esse, a causa del rapido scambio del protone, presentano una unica banda con spostamento chimico è una funzione del pH.  Ecco come il chemical shift del fosfato inorganico può fornirci una misura del pH accurata e molto utile; inoltre, la diversa suscettibilità magnetica dell’ambiente intra ed extracellulare influenza il chemical shift di nuclei come il ³¹P ed il ¹⁹F, che nei due diversi ambienti è notevolmente diverso permettendo così di calcolare in una unica misura il pH sia intra che extracellulare.  Altri gruppi di reazioni molto interessanti da studiare con la spettroscopia NMR sono la glicolisi e il ciclo di Krebs all’interno delle cellule, utilizzando biomolecole marcate con ¹³C, seguendo la comparsa del tracciante nei composti intermedi e misurando la velocità delle reazioni cui prendono parte questi composti.  La spettroscopia NMR permette di misurare in tempo reale il decorso di queste reazioni. Se dovessimo estrarre questi composti dalle cellule ciò comporterebbe tempi molto superiori, perdita significativa di sostanza e, in definitiva, risultati non affidabili.  Ma non solo. A nche studi in vivo sono possibili, per esempio per monitorare il metabolismo durante l’ esercizio.  Monitorando i derivati fosforici è possibile determinare i livelli di ATP, fosfocreatina e il pH per capire le dinamiche con cui viene creata l’energia necessaria a supplire allo sforzo fisico.

HR-MAS NMR per studio metabolomico

Rimanendo in campo medico, un’importante approccio alla diagnosi di patologie o anomalie nell’organismo che ha visto un forte sviluppo negli ultimi tempi è la metabolomica, ovvero lo studio del set completo di metaboliti, molecole con peso molecolare solitamente inferiore ai 1500 kDa, presenti in un determinato campione biologico.   Perché è importante questo aspetto?   La possibilità di diagnosticare stati patologici, la loro progressione e l’efficacia dei trattamenti attraverso la conoscenza dei meccanismi molecolari che stanno alla base di una malattia è un obiettivo quanto mai ambizioso e molto difficile da raggiungere.  Molte patologie hanno un carattere complesso e multifattoriale e la loro diagnosi non può basarsi soltanto sulla valutazione di un singolo marcatore molecolare.  Questo fa sì che acquistino molta importanza approcci volti alla definizione di un profilo molecolare dei singoli individui, a partire da geni, RNA, proteine e metaboliti.

HR-MAS NMR: un angolo magico per tante applicazioni

La spettrometria di massa e la risonanza magnetica nucleare sono le metodiche tecnologiche più utilizzate in metabolomica.   Permettono di acquisire informazioni dettagliate e preziose in merito alle classi di molecole e alle strutture e pesi molecolari dei singoli metaboliti in condizioni diverse.   Lo studio del profilo metabolico via NMR, in particolare, ha il vantaggio non richiedere manipolazione del campione sia in caso di fluidi biologici sia in caso di tessuti e cellule.   In quest’ultimo caso si utilizza una modalità operativa particolare, chiamata HR-MAS NMR, acronimo per “high-resolution magic angle spinning”, che permette di indagare su materiali con una consistenza tra solido e liquido.  E quale applicazione migliore se non quella di studiare i tessuti molli o le cellule?

angolo magico

Il principio di questa tecnica si basa sul fatto che facendo ruotare il campione con un’inclinazione tale da formare un angolo θm , detto appunto angolo magico, con la direzione del campo magnetico, le linee dello spettro più esterne diventano più strette, con un cospicuo guadagno in risoluzione, maggior semplicità nell’analisi dello spettro e nell’identificazione del composto.
L’applicazione di questa tecnica inizialmente era concentrata quasi esclusivamente sull’analisi di molecole organiche su fase solida e sintesi peptidica o analisi di prodotti da chimica combinatoriale in fase solida. Si tratta a dire il vero di una tecnica che sta assumendo sempre più importanza negli ultimi anni, grazie alla quale si è in grado di compiere studi di notevole importanza in ambito chimico qualora si voglia studiare la struttura di una specie in fase solida.   Si pensi, ad esempio, al polimorfismo e alle problematiche ad esso connesse, in ambito chimico-farmaceutico in primis: questa tecnica ci offre la possibilità di ottenere risultati estremamente interessanti e utili al fine di evidenziare differenze anche minime tra i diversi polimorfi, dettagli difficili da evidenziare con altre tecniche.
La carta vincente della spettroscopia NMR allo stato solido rispetto a quella in soluzione è data dalla capacità di dare informazioni strutturali anche su composti di cui non è possibile ottenere la struttura dai raggi X, come campioni in polvere che presentano cristallinità a breve raggio o amorfi o, ancora, atomi di idrogeno, in particolare quando danno origine alle interazioni di legame idrogeno.   Questa ricchezza di informazioni, d’altro canto, ha rappresentato la fonte dei problemi che inizialmente avevano impedito la diffusione di questa tecnica allo stato solido.  La spettroscopia NMR misura le componenti delle interazioni magnetiche lungo la direzione del campo statico applicato, quali l’interazione Zeeman, l’interazione dipolare, l’interazione quadrupolare e l’anisotropia del chemical shift.   Le interazioni interessanti che ci forniscono informazioni sulla struttura chimica allo stato solido diventano anisotrope, ovvero dipendono dall’orientazione e subiscono variazioni dipendenti dagli angoli relativi al posizionamento della specie in esame rispetto al campo magnetico esterno applicato. In un liquido i rapidi e casuali moti molecolari rendono il mezzo isotropo e mediano l’anisotropia delle interazioni, mentre in fase liquida l’interazione dipolare ha un valore medio isotropo nullo, per cui non si osserva. In un solido l’assenza di moti isotropi fa sì che lo spettro NMR dipenda dalle diverse orientazioni delle molecole rispetto al campo e dalla loro distribuzione, come la frequenza di risonanza di un dato nucleo dipende dall’orientazione, rispetto al campo, della molecola che lo contiene.  Poiché in un solido tutte le direzioni sono contemporaneamente possibili, uno stesso nucleo potrà risuonare a chemical shift differenti, dipendenti dall’orientazione della molecola rispetto al campo; se, infatti, l’anisotropia del chemical shift in soluzione viene mediata dai moti ad un valore isotropo, questo non avviene nel solido, dove da origine ad una grandezza tensoriale caratterizzata da tre valori, corrispondenti alle tre direzioni ortogonali nello spazio.

probe per HR-MAS-NMR

Dato che le interazioni studiate con la NMR hanno una forte dipendenza angolare e la somma di tutti i contributi forniti creerebbe un sistema estremamente complesso da interpretare, è necessario adottare un sistema che permetta di identificare un solo contributo significativo su cui basare lo spettro della specie chimica in questione.  Questo è possibile, appunto, grazie alla rotazione ad angolo magico, che annulla l’effetto delle anisotropie delle diverse interazioni: facendo “spinnare” il campione con un angolo di 54,7° rispetto al campo magnetico applicato, è possibile mediare le disomogeneità del campo stesso e rimuovere gli effetti secondari sopracitati.   Ma attenzione, ciò avviene solo se la frequenza di rotazione è considerevolmente maggiore della frequenza in condizioni anisotrope; a frequenze inferiori si osservano bande rotazionali (spinning side-bands), distanziate di intervalli multipli della frequenza di rotazione.
Fra i possibili utilizzi di questa tecnica riscuote un discreto successo lo studio dei polimeri i quali, però, avendo una struttura piuttosto rigida, non possono essere analizzati tal quali, ma devono essere dispersi in una piccola quantità di un opportuno solvente, ottenendo così un sistema che rispecchi un regime semi-solido.  L’osservazione della formazione di legami e cross-linkings nella produzione di polimeri o di materiali da essi costituiti può essere monitorata efficientemente grazie a questa tecnica: corretta conformazione e porosità delle fasi stazionarie usate in analitica, processo di vulcanizzazione della gomma e trattamento di polietilenglicole sono solo alcuni tra gli esempi di applicazione alla scienza dei materiali.

metabolomica via NMR su cellule di linfoma

Nel corso degli anni anche i biologi si sono affidati a questa metodica e, al momento, sono numerosissimi gli studi in tal campo che fanno capo al suo utilizzo, grazie al fatto che è possibile studiare l’organo intatto in cui si intende ricercare il metabolita o la classe di molecole di interesse invece di procedere all’estrazione dall’organo stesso, rischiando di perderne una notevole quantità e di non arrivare ad una resa significativa.   Acquisire dati direttamente dal tessuto tal quale assicura che non vi sia una perdita di prodotto, ma nemmeno una sua alterazione nel processo di estrazione.   L’analisi diretta di tessuti utilizzando la tecnica NMR classica è limitata a causa delle risonanze esterne dovute all’irregolarità della forma nel campione e alle disomogeneità nel tessuto.   L’HR-MAS è stata utilizzata per studiare diversi tipi di tessuti, tra cui fegato, cervello, prostata e tessuti tumorali; i tessuti, una volta eliminati gli elementi superflui, vengono alloggiati all’interno di un rotore con una piccola quantità di D₂O (acqua deuterata, in cui l’atomo di idrogeno è stato sostituito con l’isotopo deuterio) contenente una sostanza con chemical shift noto.   In questo modo è possibile, oltre a studiare i metaboliti, discriminare tra un tessuto sano e uno malato, anche in casi in cui l’esame istologico non dia risultati accurati.   Nonostante questo tipo di tecnica dia luogo a spettri di una qualità notevole rispetto a quelli ottenibili con la tecnica convenzionale, per le ragioni citate poc’anzi sulla frequenza di rotazione e, in alcuni casi, legate alla natura del materiale in oggetto, la risoluzione non sempre è delle migliori.

Studi di interazione in risonanza magnetica

Ad un livello più microscopico ma altrettanto interessante è lo studio delle interazioni tramite NMR: parliamo delle interazioni ligando-proteina, ad esempio, che ci permettono di capire la modalità con cui una data molecola, di qualsiasi natura essa sia, interagisce con una struttura proteica, come un enzima.   Quali siti vengono coinvolti?   Che tipo di legami si instaurano tra le due specie?   Questo tipo di studi riveste una notevole importanza in ambito biomedico tanto quanto in altri campi disciplinari.  Quando due sostanze interagiscono influenzano notevolmente il proprio intorno chimico e questa influenza porta a cambiamenti nell’assetto e nella distribuzione della nube elettronica che possono essere rilevati dalla RM.

interazione ligando-recettore

In cosa consiste l’interazione proteina-ligando e perché è così importante?   Questa accoppiata può essere costituita da diverse combinazioni come enzima-substrato, enzima-DNA, proteina-DNA e tante altre; lo studio dell’interazione di queste due specie può essere molto utile, ad esempio, per individuare siti di legame e trarre informazioni preziose per il design razionale di farmaci o per studiare il riconoscimento proteina-ligando a livello atomico.  Inoltre, è utile per compiere studi di “screening” selezionando tra una larga libreria di composti quelle sostanze che mostrino una ottimale capacità di legame con il sito in questione.   Il tutto è possibile grazie all’osservazione di alcuni parametri che possano mostrare un’apprezzabile cambiamento in seguito al verificarsi di un’interazione come lo spostamento chimico e l’intensità del segnale, nonché i tempi di rilassamento dei nuclei.
Le modalità operative sono tante.   E’ possibile utilizzare metodi che permettano di separare i segnali del ligando da quelli della proteina, con la possibilità di analizzare allo stesso tempo i siti di legame della proteina e le regioni del ligando che interagiscono con la proteina, nonché la conformazione strutturale di entrambi.   Inoltre, marcando la proteina con atomi ¹³C e ¹⁵N è possibile selezionare i segnali in funzione del tipo di nucleo cui sono legati i protoni eccitati, con l’opportunità, oltre a ciò, di studiare il sistema in 2 dimensioni per collegare tra loro i segnali relativi ai vari nuclei e capire “chi è legato a cosa”.
La spettroscopia bidimensionale 2D-NMR, detta in gergo NMR-COSY, è una delle principali tecniche di risonanza magnetica nucleare che permettono indagini strutturali delle molecole e che si basano sull’accoppiamento del normale spettro NMR con un altro relativo ad un’altra radiazione in modo da ottenere uno spettro in 2 dimensioni.  Il termine bidimensionale indica che le due frequenze di radiazione presentano due diverse scale dei tempi indipendenti.  Lo spettro ottenuto è rappresentato in tre dimensioni, dove sugli assi x e y sono riportati due spettri NMR relativi ad analisi su uno stesso campione.  Si tratta di una tecnica molto utilizzata, soprattutto quando l’interpretazione del normale spettro NMR non è semplice o ci si trova davanti ad una sostanza ignota di cui non si conosce minimamente la struttura.

Alimenti e qualità: tutto sotto controllo?

E se in ambito biomedico le applicazioni sono sempre in crescita, anche il campo agro-alimentare trae non pochi benefici dall’uso della spettroscopia NMR.  L’importanza del controllo di qualità sui cibi e, in particolar modo, delle sofisticazioni e contraffazioni sta crescendo sempre di più, anche tenendo conto del fatto che la filiera produttiva è sempre più estesa e spesso fa capo a fornitori di aree geografiche diverse, con legislazioni differenti e con una relativa difficoltà nella reale tracciabilità delle materie prime. Vino e latte, solo per citarne alcuni, sono tra gli alimenti più soggetti a questo tipo di problematiche, e le tecniche di indagine si stanno affinando sempre di più in questo campo.  Garantire la qualità di un prodotto del settore agroalimentare con degustazioni e valutazioni empiriche non è più possibile, la necessità impellente è quella di determinare con assoluta obiettività e certezza la composizione molecolare dei prodotti.  Il consumatore deve essere messo nelle condizioni di effettuare scelte consapevoli avendo a disposizione valori derivanti da analisi rigorose degli alimenti.  In campo alimentare la spettroscopia NMR è utilizzata per valutare sia la qualità dei prodotti di origine controllata sia le frodi e le sofisticazioni.  Anche in questo caso lo sviluppo dell’HR-MAS risulta alquanto prezioso, consentendo di rilevare dettagli importantissimi ai fini della qualità come, ad esempio, la percentuale di latte di bufala in una mozzarella d.o.p.   Anche l’olio d’oliva, uno degli alimenti simbolo della nostra dieta, spesso soggetto a frodi, rappresenta una perfetta matrice su cui eseguire analisi con questa tecnica, permettendo di ricavarne l’origine e l’eventuale presenza di altri oli diversa natura aggiunti.
Ma non ci fermiamo qui; moltissime sono le applicazioni possibili per l’analisi di caffè, tè, carni, fino ai succhi di frutta e gli aromi naturali.
Proprio a proposito della contraffazione è molto interessante notare come anche il questo caso lo studio della metabolomica giochi un ruolo determinante.  La possibilità di individuare metaboliti e creare un imprinting molecolare che rimandi direttamente ad una varietà alimentare, consentendo allo stesso tempo di rilevare differenze nella composizione in modo veloce è un valore aggiunto che questa tecnica ci fornisce.  Grazie all’NMR ad alta risoluzione siamo in grado di rilevare i segnali relativi ai nuclei di H di metaboliti in alimenti, che vengono poi elaborati e semplificati grazie a metodi chemiometrici.  In particolare, la possibilità di sottoporre un singolo campione ad una serie di esperimenti diversi, ci consente di ottenere informazioni diverse e complementari tra loro.  Molto importante questo discorso per quanto riguarda lo studio del latte e dei suoi derivati, possibile da eseguire sia allo stato liquido che allo stato semisolido.  In quest’ultimo caso, in particolare, si utilizza l’HR-MAS, una delle migliori soluzioni per l’analisi di latticini in quanto consente di evitare il trattamento preliminare e di osservare allo stesso tempo le componenti idrofobiche e idrofile, riducendo notevolmente il tempo d’analisi di ciascun campione.  Dato il notevole affollamento di segnali dovuti alle classi di composti rilevate, è necessario poi ricorrere all’analisi statistica per “ordinare” e alleggerire lo spettro in modo che risulti facilmente interpretabile.

spettro NMR ad alto campo del vino

L’alimentazione nel nostro paese può definirsi uno dei vanti maggiori, i prodotti di tutta la penisola vengono invidiati e imitati in tutto il resto del mondo. Olio, vino, pasta in cima al podio si aggiudicano il titolo di alimenti tipici, con denominazioni di origine controllata e una serie di antiche tradizioni alle spalle.
Come abbiamo detto per i formaggi, anche il vino ha la sua nicchia di caratteristiche peculiari che lo rendono unico e prezioso.  Basti pensare ai tentativi di sofisticazione e imitazione di cui continuamente si sente parlare e che lo rendono una vera “specie protetta”!  Il vino come la maggior parte delle sostanze alimentari è una miscela complessa di decine di composti chimici diversi.   Se si mescolano insieme due vini si ottiene una miscela la cui complessità è simile a quella dei vini d’origine.  Per tale motivo determinare la percentuale di ciascun vino presente nella miscela è un problema analitico molto più complesso che l’identificazione dei singoli composti presenti. Inoltre, per poter identificare un sistema complesso, quale un vino, all’interno di un sistema altrettanto complesso quale una miscela di vini, è necessaria una conoscenza sufficientemente dettagliata di ciascuno dei costituenti. La risonanza magnetica nucleare ci permette una caratterizzazione di sistemi complessi quali le sostanze alimentari poiché è possibile determinare simultaneamente un numero elevato di composti.  Poiché il profilo metabolico di un vino ha una variabilità naturale legata alle materie prime e ai metodi di produzione, il riconoscimento del profilo NMR di ciascun vino all’interno della miscela richiede l’utilizzo di tecniche statistiche avanzate.
Ma non è tutto.  Anche l’aceto balsamico, altro vanto della nostra tradizione culinaria, nella sua versione originale e tradizionale non conosce pari.  E’ notoriamente un prodotto molto antico proveniente esclusivamente dalla zona di Modena e Reggio Emilia con metodi di preparazione del tutto particolari tramandati di generazione in generazione, ottenuto dalla fermentazione alcolica ed acetica del mosto cotto e concentrato mediante una prima fase di maturazione ed un lento invecchiamento in botti di legno per diversi anni, spesso e volentieri anche fino a 25 anni.  Non è difficile immaginare come la ridotta accessibilità ad un prodotto di questo genere, per i costi e per il lungo tempo necessario alla sua produzione, abbia dato adito, esattamente come nel caso del vino, alla produzione di una tipologia di aceto balsamico molto “semplificato”.  L’aceto balsamico di Modena, senza denominazioni particolari, è infatti un prodotto ottenuto industrialmente da mosto cotto cui viene addizionato aceto di vino e un colorante, il caramello E150, per conferire la colorazione scura tipica. In questo caso la maturazione in botte varia dai 60 giorni ad un massimo di tre anni per il prodotto definito invecchiato.  E’ assolutamente d’obbligo, quindi, ai fini di garantire una corretta denominazione di origine protetta e alta qualità al consumatore, eseguire un controllo che permetta di discriminare tra le varie tipologie di aceto.  Anche un consumatore non attento si accorgerà della lampante differenza tra l’aceto comprato sullo scaffale del supermercato ad un prezzo basso e quello reperibile in un’acetaia, ma è di gran lunga più difficile accorgersi di una sofisticazione o stabilire l’età di un aceto balsamico solo guardandolo.  Ma anche in questo caso le tecniche analitiche hanno fatto passi da gigante e la risonanza magnetica ci regala ancora una volta grosse soddisfazioni.  Nel caso dell’aceto balsamico, ad esempio, accoppiando la gas-cromatografia all’NMR otteniamo uno spettro di informazioni davvero ampio.  L’analisi GC, infatti, permette di quantificare molti componenti come zuccheri, acidi organici, amminoacidi e, soprattutto, aromi, costituenti fondamentali per questo tipo di prodotto.  D’altro canto, dallo spettro NMR rileviamo l’impronta digitale del prodotto, che permette di ottenere un gran numero di informazioni in una sola analisi e consente la discriminazione degli aceti balsamici commerciali da quelli tradizionali, tra aceti balsamici tradizionali prodotti in diverse acetaie e infine tra aceti balsamici tradizionali a diverso grado di invecchiamento.  Non male, no?

In definitiva, se pensiamo a tutte le applicazioni descritte finora, che coprono campi disciplinari molto distanti tra loro e se pensiamo, soprattutto, a tutto quello che ancora aspetta di essere scoperto, possiamo affermare molto sicuramente che la risonanza magnetica nucleare è stata e continuerà ad essere un’ottima e insostituibile risorsa tecnologica.

Questo articolo vuole essere un breve excursus sulle nanoparticelle, in particolare sulle nanoparticelle metalliche e organiche. Essendo il campo trattato molto vasto e complesso, viene qui fornita solo un’introduzione generale dell’argomento, rimandando la trattazione approfondita di ogni singola tipologia di nanosistemi ad articoli monografici.

(Fig. 1) Nanoparticelle d’oro osservate tramite microscopio elettronico a trasmissione (TEM)

Oggigiorno, quasi quotidianamente, sentiamo parlare di nanoparticelle.  A volte in accezioni negative, come quando si parla di inquinamento da polveri sottili, a volte in termini positivi, come quando si descrivono nuovi materiali o nuovi trattamenti medici.
Ma da cosa e come sono fatte le nano-entità?  Quali potenzialità offrono?  E perché la ricerca è così attiva in questo campo?
Occorre premettere che esistono tantissimi tipi di nanoparticelle, per cui una classificazione organica risulta alquanto difficile, tuttavia, possono essere schematicamente raggruppate in tre grandi macro-famiglie: inorganiche, costituite da metalli e semiconduttori, ibride (inorganiche/organiche) e totalmente organiche.  Ciascun gruppo raccoglie una vastissima gamma di nanostrutture con differenti proprietà e differenti campi di applicazione.  Si va, ad esempio, dal settore bio-medicale, al fotovoltaico, all’optoelettronico, fino al cosmetico.

Una nanoparticella viene generalmente definita come una struttura di dimensioni da due fino ad un centinaio di nanometri (nm).  Immaginiamo una tacca di un millimetro su un righello, dividiamola in mille parti, una di queste mille parti dividiamola in dieci parti.  Otteniamo cento nanometri.  Da questa semplice visualizzazione si può capire quanto siano piccole queste strutture, talmente piccole da non poter essere osservate con un comune microscopio ottico, ma di necessitare di particolari microscopi, come il microscopio elettronico a trasmissione o il microscopio a forza atomica (Figura 1).

(Fig. 2) Vaso di Licurgo (400 DC). La coppa da verde assume colorazione rosso-arancio se attraversata dalla luce grazie alle nanoparticelle d’oro e d’argento di 30-70 nanometri all’interno del vetro (British Museum). In basso: una sospensione di nanoparticelle d’oro

Storicamente, le prime nanoparticelle utilizzate dall’uomo furono le nanoparticelle metalliche d’oro e argento a causa delle loro particolari proprietà ottiche, tali per cui erano in grado di conferire al vetro diverse colorazioni. Una sospensione di nanoparticelle d’oro sferiche, infatti, non ha colorazione giallo-oro, come ci si potrebbe aspettare dall’osservazione di un pezzo d’oro, ma colorazione arancio-rossa (Figura 2).  Tale fenomeno è dovuto al fatto che le proprietà dei materiali, a seconda che siano strutturati in bulk o in nanosistemi, possono cambiare radicalmente. In particolare, nel caso di nanoparticelle metalliche, gli elettroni di conduzione sono confinati in dimensioni nanometriche.  Quando la nanoparticella viene colpita da una radiazione elettromagnetica (come può essere una radiazione luminosa), gli elettroni di conduzione iniziano ad oscillare, comportandosi come oscillatori forzati accoppiati. La frequenza di oscillazione collettiva di questi elettroni prende nome di risonanza plasmonica di superficie localizzata ed è responsabile della colorazione caratteristica delle nanoparticelle.  Modulandone la forma, ad esempio da sferica a cilindrica, è possibile cambiare la frequenza di risonanza, ottenendo così nanoparticelle d’oro da più svariati colori, dal blu, fino al rosso.  Tali fenomeni sono tipici delle nanoparticelle metalliche.
Attualmente i campi di applicazione delle nanoparticelle metalliche sono in continua espansione e la ricerca è molto attiva in questo campo da tanti anni  Ecco alcuni esempi di utilizzo:
Terapia fotodinamica: vi sono nanoparticelle d’oro (nanoshell e nanofili) in grado di produrre calore se eccitate a 700 – 800 nm. Tali nanoparticelle vengono opportunamente funzionalizzate in superficie con gruppi studiati per il riconoscimento di cellule tumorali. Le cellule tumorali che hanno “inglobato” tali nanoparticelle vengono quindi uccise dal calore sprigionato dai nanosistemi.
Catalisi: vengono utilizzate come efficienti catalizzatori in diverse reazioni chimiche, ad esempio la reazione di ossidazione del glucosio ad acido gluconico o la reazione di metil glicolato a partire da glicole etilenico e metanolo.
Diagnostica: possono essere utilizzate in un’ampia varietà di sensori.  Molto interessante è la tecnica SERS (Surface Enhanced Raman Spectroscopy) in cui le nanoparticelle vengono utilizzate come substrato su cui vengono depositate le molecole da analizzare; la presenza delle nanostrutture è in grado di amplificare fortemente il segnale Raman rendendo la tecnica sensibile anche all’analisi di singola molecola.

Sospensione acquosa di nanoparticelle d’oro

Passando dal campo inorganico al campo organico, un tipo di nanoparticelle su cui la ricerca si è concentrata solo negli ultimi anni, ma che risultano fortemente promettenti in diversi ambiti come il fotovoltaico, il medicale e l’optoelettronico sono le nanostrutture totalmente organiche.   Esse hanno le peculiarità di essere costituite essenzialmente da materiali “soft” come polimeri o piccole molecole e, quindi, di avere potenzialmente tossicità minore rispetto alle nanoparticelle costituite da metalli o semiconduttori.  Questo aspetto risulta molto importante sia da un punto di vista di impatto ambientale, sia per quanto riguarda le applicazione biomedicali. Esistono numerosi tipi di nanoparticelle organiche, tra cui si possono annoverare ad esempio i nanodots organici, i nanoaggregati, le nanoparticelle polimeriche, le nanoemulsioni (sistemi micellari).
I nanodot sono nanostrutture in cui i cromofori, di uno o più tipi, sono legati covalentemente ad una struttura dendrimerica (Figura 3, sinistra).  Il loro vantaggio è quello di poter avere struttura, numero di cromofori e grandezza controllati ma, di contro, la sintesi può risultare molto lunga e dispendiosa.

(Fig. 3) A sinistra: struttura schematica di un nanodot organico. I cromofori (in giallo) sono legati covalentemente alla struttura dendrimerica (in nero). A destra: struttura schematica di un nanoaggregato organico costituito da due tipi di cromofori (verdi e arancioni)

I nanoaggregati organici, chiamati comunemente anche nanoparticelle organiche, sono nanoparticelle costituite da uno o più tipi di cromofori non legati covalentemente, ma tenuti insieme da forze attrattive deboli (Figura 3, destra).  La loro preparazione risulta molto semplice e veloce, di contro, è molto difficile riuscire a controllare le dimensioni finali delle nanostrutture ottenute. Vengono comunemente sintetizzate utilizzando un metodo chiamato riprecipitazione: un’aliquota di soluzione concentrata di cromoforo, disciolto un solvente organico miscibile in acqua (come acetonitrile, etanolo o tetraidrofurano), viene aggiunta ad un grande volume di acqua. Anche se il processo non è stato ancora intimamente compreso, la formazione delle nanoparticelle viene ad oggi spiegata secondo la teoria di nucleazione classica: dal momento che il cromoforo utilizzato non è solubile in acqua, il cambio repentino dell’intorno provoca il raggiungimento del livello di sovrassaturazione.   Di conseguenza si ha l’aggregazione delle molecole e la formazione delle nanoparticelle (Video 1).  Con lo stesso metodo possono essere preparate anche nanoparticelle polimeriche.

Le nanoemulsioni, invece, vengono ottenute con un metodo di preparazione completamente diverso: le molecole (o i polimeri) vengono sciolti in un solvente organico immiscibile in acqua.  All’acqua viene aggiunto un tensioattivo in concentrazione superiore alla concentrazione micellare critica. Si uniscono fase acquosa e organica sotto agitazione o sonicazione per ottenere la nano/micro emulsione.  Questi tipi di micro/nanostrutture sono molto usate nei settori medicale o cosmetico, esse infatti, permettono di ottenere sospensioni colloidali acquose di molecole liposolubili.  Sono quindi principalmente studiate e applicate in sistemi a rilascio di farmaci o come veicolanti di principi attivi cosmetici.

(Fig. 4) Nanoparticelle organiche osservate tramite il microscopio elettronico a trasmissione (barra 150 nm).

Qualora venga utilizzato un solvente organico volatile, come ad esempio cloroformio o diclorometano, è possibile asportare tale solvente dall’interno delle micelle tramite evaporazione sotto vuoto.   Questo permette di ottenere nanoaggregati di molecole organiche, come quelli ottenuti mediante tecnica di riprecipitazione, ma a dimensione controllata.   Il tensioattivo può essere rimosso per centrifugazione e successivi risciacqui.
Le applicazioni più comuni dei nanodots e nanoaggregati organici sono il settore medicale dove ad esempio vengono utilizzate come sonde (materiali di contrasto) per la microscopia bifotonica in vivo, il fotovoltaico organico e le applicazioni optoelettroniche in generale.

Un organismo vivente è un sistema chimico complesso nel quale la materia organica viene sintetizzata, riprodotta, trasformata e decomposta in un incessante ed intenso susseguirsi di reazioni e processi chimici attraverso i quali si svolgono tutte le funzioni biologiche.
Noi sappiamo che la materia vivente è costituita in gran parte da polimeri naturali riconducibili a tre tipi fondamentali : proteine, acidi nucleici, carboidrati.  A questi si aggiungono i lipidi, l’acqua , i sali minerali, altre sostanze particolari come le vitamine ed infine i catalizzatori biologici o enzimi, una categoria di proteine globulari protagonisti di reazioni chimiche che si svolgono normalmente all’interno delle cellule. Queste reazioni chimiche sono caratterizzate da un elevato valore dell’energia libera di attivazione (l’energia minima necessaria ad un sistema per innescare una reazione chimica ) e quindi, perché possano avvenire regolarmente, necessitano di adatti catalizzatori biologici ( vedere articolo “i tempi della chimica: la velocità dei processi di trasformazione della materia confrontati alla scala dell’uomo”).

(Fig. 1) Energia libera di attivazione o energia minima necessaria che le molecole devono possedere durante l’urto, affinchè la reazione chimica avvenga. Gli enzimi svolgono la loro funzione come catalizzatori biologici della materia vivente diminuendo l’energia libera di attivazione affinchè una determinata reazione chimica possa avvenire spontaneamente.

Abbassando il valore dell’energia libera di attivazione , si ottiene chiaramente una accelerazione della reazione chimica senza alterare l’equilibrio della reazione stessa e inducendo nuove vie in cui lo stato di transizione (la specie molecolare più ricca di energia) possiede livelli di energia libera più bassi e più facilmente raggiungibili rispetto alla reazione non catalizzata.  Questo è il principio su cui si basa l’azione dei catalizzatori cioè abbassare l’energia libera di attivazione della reazione per facilitare così il passaggio dallo stato iniziale (reagenti) allo stato finale (prodotti) (Fig.1) senza modificare gli equilibri della reazione.

Se così non fosse, queste reazioni chimiche potrebbero avvenire per semplice contatto e quindi disordinatamente senza alcuna regola, laddove invece è necessaria la massima precisione nel selezionare tra tutte le reazioni possibili quelle utili a determinati fini.
Ma chi si incarica di disciplinare e di organizzare le reazioni chimiche negli organismi viventi facendole avvenire quando, dove e come è necessario ? La risposta è chiara: sono gli enzimi, i più importanti catalizzatori biologici che determinano tutte le trasformazioni chimiche cellulari. Essi possono anche mediare l’interconversione tra diverse forme di energia.
Le loro più importanti caratteristiche sono il potere catalitico (possono aumentare la velocità di una reazione pari a 106 volte) e la specificità (nel senso che risultano specifici sia per la reazione catalizzata sia per la scelta dei reagenti, chiamati substrati) e la loro azione è soggetta a regolazione (ad esempio gli enzimi che catalizzano le prime tappe delle vie biosintetiche sono in genere inibiti dal prodotto finale, una specie di sistema di controllo chiamato inibizione a feedback o enzimi controllati da proteine regolatrici dagli effetti inibitori o stimolatori oppure enzimi controllati dall’attacco reversibile di gruppi fosforici a residui specifici di serina e di treonina).

(Fig. 2) Hermann Emil Fischer (1852–1919): è stato un chimico tedesco che diede un grande contributo al progresso della Biochimica e della Chimica organica classica. Ottenne il Premio Nobel nel 1902 per la chimica nel campo della configurazione stereochimica degli zuccheri.

Un enzima è perciò in grado di provocare l’ossidazione di un determinato gruppo aldeidico o di un gruppo alcoolico o ancora la rottura di un certo legame peptidico o la sua formazione.  L’alta specificità si spiega col fatto che l’azione catalitica viene svolta non dall’intera molecola enzimatica ma solo da un punto determinato di essa definito centro attivo o sito attivo cioè la regione della proteina enzimatica che entra in contatto con il substrato e il gruppo prostetico se è presente e che contiene i residui aminoacidici che partecipano direttamente alla formazione o alla rottura dei legami chimici.  I residui aminoacidici prendono anche il nome di residui catalitici.  La funzionalità del sito attivo è strettamente dipendente dalla struttura spaziale della molecola enzimatica.

Il gruppo prostetico degli enzimi è detto anche coenzima e la parte proteica invece è chiamata apoenzima.  I coenzimi sono costituiti spesso da vitamine o da derivati delle vitamine.   Alcuni metalli come magnesio (Mg), ferro (Fe), zinco (Zn), potassio (K), manganese (Mn) si rivelano importanti per la funzionalità di alcuni enzimi : vengono qualificati di solito come cofattori.
I siti attivi degli enzimi possiedono alcune caratteristiche in comune:
1. Il sito attivo è una parte relativamente piccola della molecola enzimatica e la maggior parte degli aminoacidi non sono in contato con il substrato;
2. Il sito attivo è una entità tridimensionale formata da gruppi che derivano da parti diverse della sequenza aminoacidica lineare;
3. I substrati si legano all’enzima per mezzo di un certo numero di attrazioni deboli (legami elettrostatici, legami idrogeno, forze di van der Waals, interazioni idrobobiche)
4. I siti attivi sono cavitò a fenditure dove l’acqua è in genere esclusa a meno che non sia un reagente e il carattere non polare della fenditura permette il legame del substrato.
5. La specificità del legame dipende dalla precisa disposizione degli atomi in un sito attivo.

Per adattarsi al sito attivo, il substrato deve possedere una forma appropriata. H. E. Fisher nel 1890 (Fig. 2) spiegò in modo semplice attraverso il “modello chiave- serratura” (Fig.3 ) le relazioni strutturali tra substrato ed enzima.  Più tardi nel 1958 D. E. Koshland (Fig.4) postulò il modello del riconoscimento dinamico chiamato “adattamento indotto” in cui affermava che il sito attivo di alcuni enzimi era in grado di modificarsi profondamente quando si legava al substrato cioè che poteva presentare forme complementari al substrato solo dopo il legame con il substrato (Fig.5 ) .

(Fig. 5) Schema del modello dell’adattamento indotto

Anche se tutti gli enzimi conosciuti appartengono hanno struttura proteica, la scoperta alla fine degli anni settanta da parte di T. Cech (Fig. 6) e di  S.Altman (Fig.7)  di molecole di RNA cataliticamente attive (Ribozimi) sta ad indicare che le proteine non hanno il monopolio assoluto della catalisi.  Queste molecole di RNA catalitico possono aver preceduto le proteine enzimatiche nell’evoluzione.

(Fig. 3) modello chiave-serratura

La prima tappa della catalisi è la formazione di un complesso enzima- substrato.  I substrati si legano alla fessura del sito attivo da cui l’acqua viene esclusa quando il substrato è legato.  La specificità dell’interazione tra enzima e substrato è determinata principalmente da legami idrogeno direzionali e dalla forma del sito attivo che rifiuta molecole con una struttura non complementare.
Il riconoscimento del substrato da parte dell’enzima è quindi un processo dinamico accompagnato da una modificazione conformazionale.  Se prendiamo in considerazione il modello di Michaelis–Menten, con questo modello si possono spiegare le proprietà cinetiche degli enzimi.   Infatti, i principi generali della cinetica delle reazioni chimiche sono applicabili anche alle reazioni catalizzate dagli enzimi ma queste ultime presentano una caratteristica particolare non osservata di solito nelle reazioni non enzimatiche, cioè il fenomeno della saturazione da parte del substrato.

L’effetto della saturazione portò L. Michaelis (Fig. 8 ) e M. L. Menten (Fig. 9) a formulare, nel 1913, una teoria generale dell’azione e della cinetica enzimatica, che più tardi fu ampliata da G. E. Briggs e J. B. S. Haldane.  Questa teoria, fondamentale per la valutazione quantitativa dell’attività e dell’inibizione enzimatiche, prende in considerazione le reazioni considerate reversibili.

(Fig. 4, sx) Daniel Edward Koshland, Jr. (1920- 2007) è stato un biochimico americano. I suoi primi lavori sulla cinetica enzimatica alla Rockefeller University di New York lo portarono a proporre il modello di adattamento indotto per la catalisi enzimatica.
(Fig. 6, centro)Thomas Cech (1947 – ): biochimico statunitense, Premio Nobel per la chimica nel 1989 condiviso con Sidney Altman per i suoi studi di biologia molecolare sulla trascrizione genica e sulle modificazioni che portano alla formazione nel nucleo cellulare di mRNA maturo a partire dal suo neosintetizzato precursore, in particolare sul meccanismo di splicing.
(Fig. 7, dx) Sidney Altman (1939 – ) : chimico statunitense di origine canadese, vincitore del Premio Nobel nel 1989 per aver dimostrato la caratteristica propria dell’acido ribonucleico ad agire da catalizzatore biologico. Per questa scoperta fu insignito del premio Nobel per la chimica nel 1989, in compagnia dello statunitense Thomas Cech, che arrivò allo stesso risultato pur non avendo collaborato con Altman.

Un enzima E si combina con il substrato S per formare un complesso enzima- substrato ES che poi procede per formare un prodotto P oppure dissociarsi di nuovo in E ed in S secondo la relazione:

I termini indicati con k rappresentano le costanti specifiche di velocità di reazione.  ES è un intermedio di reazione il cui basso valore di energia di attivazione permette di fare avvenire una specifica reazione, catalizzata da una specifica classe di enzimi, in modo molto favorevole (effetto catalitico). Quando ES in seguito al raggiungimento di uno stato diequilibrio dinamico assume un valore di concentrazione che si mantiene costante nel tempo, si dice che è stato raggiunto lo stato stazionario o steady state.
k1 rappresenta velocità di formazione di ES e k-1+ k2 la velocità di scissione di ES
Quando la velocità di formazione di ES è uguale alla velocità della sua scissione abbiamo:

Le parentesi quadre indicano la concentrazione molare.
La concentrazione totale dell’enzima, [E]0 è eguale alla somma della concentrazione dell’enzima legato con la concentrazione dell’enzima libero:   [E] + [ES] = [E]₀
Ricavando la concentrazione dell’enzima libero, [E], da questa relazione e sostituendola nella espressione cinetica dello stato stazionario, precedentemente descritta, si ottiene

da cui eseguendo i prodotti, è possibile ottenere la concentrazione del complesso enzima-substrato, [ES], in funzione delle concentrazioni di substrato ed enzima totale:

La velocità di formazione del prodotto è data dalla quantità di complesso enzima-substrato che si scompone in enzima libero e prodotto nell’unità di tempo:

Dividendo numeratore e denominatore del rapporto, per il termine k1, si ottiene la nota equazione di Michaelis-Menten:

dove KM è la costante di Michaelis-Menten e rappresenta un termine che ingloba altri valori costanti.

Inoltre, visto che una volta raggiunto lo stato stazionario il valore della velocità massima, Vmax, è dato dal prodotto Vmax = k2 [E]0 l’equazione di Michaelis-Menten può anche essere espressa nella forma alternativa

L’equazione di Michaelis e Menten mette quindi in relazione la velocità di formazione del prodotto V con la concentrazione del substrato [S] cioè la velocità V di formazione del prodotto è data dall’equazione di Michaelis – Menten e dove Vmax è la velocità quando l’enzima è completamente saturato con il substrato e Km, la costante di Michaelis – Menten, corrisponde alla concentrazione di substrato che determina metà della velocità massima. Vmax e Km possono essere misurate variando la concentrazione del substrato.

Essa equivale al seguente rapporto:

(Fig 8, a sx) Leonor Michaelis (1875 – 1949) biochimico tedesco , noto per il suo lavoro con Maud Menten sulla cinetica enzimatica e cinetica di Michaelis-Menten nel 1913.
(Fig. 9 a dx) Maud Leonora Menten (1879 – 1960 ) medico che ha fornito un contributo significativo alla cinetica enzimatica e all’istochimica . Il suo nome è associato in biochimica alla famosa equazione di Michaelis-Menten.

La costante di Michaelis-Menten è una grandezza caratteristica di ciascun enzima. Essa è un termine che indica quantitativamente l’affinità tra un enzima e il suo substrato: più basso è il valore di KM e più bassa sarà la concentrazione di substrato che permette di raggiungere un valore di velocità di reazione pari alla metà della velocità massima, il che indica un’ alta affinità dell’enzima per il substrato. Viceversa un alto valore di KM indica che sarà necessario più substrato per raggiungere una velocità di reazione pari alla metà della velocità massima, il che significa una minore affinità dell’enzima per il substrato. Le variazioni di temperatura e di pH e la presenza di determinate di determinate sostanze possono compromettere la funzionalità degli enzimi. Infatti, gli enzimi possono essere inibiti da piccole molecole specifiche o da ioni.  Alcuni ioni di metalli pesanti come mercurio (Hg) e Piombo (Pb) risultano pericolosi in quanto capaci di legarsi ai gruppi – SH dei residui di cisteina di molti enzimi, determinandone così il cambiamento di struttura terziaria e la loro inattivazione.

L’inibizione è molto importante perché è uno dei meccanismi fondamentali di controllo dei sistemi biologici.   Infatti, molti farmaci o le cosiddette tossine possono agire come inibitori enzimatici.   Inoltre, l’inibizione può fornire molte informazioni sul meccanismo d’azione degli enzimi.
Tale inibizione può essere in due modi (Fig. 10):
a) reversibile
b) irreversibile

Nell’inibizione irreversibile, l’inibitore si dissocia molto lentamente dall’enzima in quanto si può legare in maniera covalente o non covalente.  Un tipico esempio di inibizione irreversibile è quello dei gas nervini particolari aggressivi chimici volatili organofosfati impiegati a uso bellico, sull’acetilcolinesterasi un enzima che degrada l’acetilcolina, un neurotrasmettitore che media la trasmissione degli impulsi dal sistema nervoso al muscolo nella placca neuromuscolare, e all’interno del sistema nervoso stesso (sinapsi colinergiche).  Al contrario, l’inibizione reversibile è caratterizzata da una rapida dissociazione del complesso enzima- inibitore. L’inibizione a sua volta può essere del tipo:
a) competitiva (reversibile)
b) non competitiva (irreversibile)

(Fig. 10) Rappresentazione di inibizione competitiva e non competitiva o acompetitiva

Un inibitore competitivo impedisce al substrato di legarsi al sito attivo e diminuisce la velocità di catalisi riducendo il numero di molecole di enzima che possono legare il substrato. Un esempio classico di inbizione competitiva si ha nel ciclo di Krebs ad opera dell’acido malonico sulla succinato deidrogenasi, enzima che rimuove due atomi di idrogeno dall’acido succinico.  L’acido malonico differisce strutturalmente dall’acido succinico perché possiede un solo gruppo metilenico invece di due tra i due gruppi carbossilici.  Nell’inibizione non competitiva l’inibitore è in grado di legare siti differenti dal sito attivo.  Dunque in grado di legare sia l’enzima libero, sia in configurazione ES. Il suo legame all’enzima genera un cambiamento conformazionale dell’enzima stesso, che può avere come conseguenza l’inibizione del legame tra enzima e substrato.  Non essendoci dunque competizione tra inibitore e substrato, l’importanza dell’inibizione dipende esclusivamente dalla concentrazione dell’inibitore stesso.

LE FUNZIONI DI ALCUNI ENZIMI

Vi sono enzimi che agiscono all’interno della cellula ( esempio : catepsina B) , altri invece dall’esterno.  Questi ultimi sono i più noti perché ad essi appartengono gli enzimi dell’apparato digerente come per esempio:

1. Le lipasi sono enzimi idrosolubili appartenenti alla categoria delle esterasi. Esse agiscono come catalizzatori nel processo digestivo dei lipidi alimentari; trasformando i trigliceridi (che costituiscono circa il 95-98% dei lipidi alimentari) in glicerolo e acidi grassi.  La principale fonte di lipasi è il pancreas ; le lipasi pancreatiche sono coadiuvate nella loro azione dalle colipasi, enzimi che favoriscono l’adesione delle lipasi alle goccioline
lipidiche.

(Fig. 11) Struttura tridimensionale della pepsina

2. La pepsina (Fig. 11 ) è stata individuata inizialmente nel 1836 e primo enzima animale ad essere stato descritto.  La pepsina, viene prodotta e secreta dalle cellule peptiche della mucosa gastrica.  Appartiene alla famiglia delle aspartil proteasi e gioca un ruolo importantissimo nella digestione delle proteine in ambiente molto acido (pH ottimale tra 2 e 3 ) scindendo i legami peptidici proteici liberando gli aminoacidi che serviranno poi per la preparazione di nuove proteine.  Essa, viene secreta come zimogeno, cioè in una forma inattiva che acquisisce capacità funzionale soltanto dopo una precisa modifica strutturale.  L’HCl secreto dalle cellule parietali dello stomaco trasforma il pepsinogeno, suo precursore, in pepsina, mediante un taglio proteolitico che porta all’allontanamento di una quarantina di aminoacidi. La pepsina attivata, a sua volta, favorisce la formazione di nuova pepsina agendo direttamente sul pepsinogeno.  A pH superiori a 3,5 (ipocloridria/acloridria), la pepsina perde buona parte della sua attività proteolitica, fino a denaturarsi irrimediabilmente a valori superiori a 5.

3. La tripsina e α-chimotripsina: sono altri due enzimi chiave nella digestione delle proteine alimentari. Appartengono alla grande famiglia delle serin proteasi come la trombina (enzima della coagulazione) aventi tutte un sito attivo molto simile e al sottogruppo delle endopeptidasi.  Entrambi sono prodotti e secreti come zimogeni, cioè in forma inattiva, dal pancreas.
La tripsina catalizza il taglio proteolitico con specificità per gli aminoacidi arginina e lisina.  Il pH ottimale per l’attività catalitica della tripsina è compreso tra 7 e 9; in realtà presenta attività catalitica anche ad altri valori di pH ma l’idrolisi mediata a pH differenti da quello ottimale, risulta più lenta.  La tripsina è dunque in grado di ridurre le proteine a polipeptidi più piccoli o singoli aminoacidi che possono essere assimilati dall’intestino: è pertanto un enzima fondamentale nella digestione delle proteine. La tripsina viene prodotta dal pancreas sotto forma di tripsinogeno inattivo, che viene quindi secreto nell’intestino tenue dove viene attivato e trasformato in tripsina per mezzo di un taglio proteolitico operato dall’enzima enteropeptidasi. La tripsina risultante con lo stesso meccanismo di taglio proteolitico, è in grado di attivare altre molecole di tripsinogeno.  Tale meccanismo di attivazione è comune a molte serin proteasi, ed è utile a prevenire l’autodigestione nel pancreas.

(Fig. 12) Struttura tridimensionale della alfa-chimotripsina. Essa contiene molte regioni con struttura beta-antiparallela e poche regioni ad alfa-elica.

La α-chimotripsina catalizza invece la rottura del legame peptidico sul lato carbonilico di aminoacidi a catena laterale aromatica (Tirosina, Triptofano, Fenilalanina) e di residui idrofobici come la metionina.  Essa è costituita da tre catene polipeptidiche unite da due ponti – S – S – intercatena (Fig. 12). Viene sintetizzata come precursore inattivo costituito da una singola catena, chiamato chimotripsinogeno.  Insieme ad altri enzimi come (carbossipeptidasi, dipeptidasi, elastasi, trombina, plasmina) completa la digestione delle proteine.
Un altro enzima simile nella struttura e nel meccanismo catalitico alla tripsina e alla chimotripsina ma non nella specificità del substrato, è l’elastasi pancreatica che attacca i legami peptidici all’interno della catena di aminoacidi con piccole catene laterali non cariche, dando origine a frammenti molecolari più piccoli.
Altri enzimi proteolitici che idrolizzano il legame peptidico carbossiterminale di aminoacidi con catena laterale aromatica o alifatica lunga sono le carbossipeptidasi pancreatiche (A e B) . Esse invece appartengono al secondo sottogruppo cioè quello delle esopeptidasi e completano il lavoro della tripsina e della chimotripsina.  La carbossipeptidasi A è un ottimo esempio di adattamento indotto nella catalisi e membro della classe delle zinco proteasi.

A questo secondo sottogruppo appartengono anche altri enzimi come le aminopeptidasi (che attaccano le estremità aminoterminale) e le dipeptidasi, entrambe prodotte e secrete dalla mucosa dell’intestino tenue.

4. Le Amilasi sono enzimi che catalizzano la degradazione di legami oligosaccaridici e polisaccaridici al fine di ottenere composti più semplici, come i disaccaridi.  Esistono diverse amilasi:

a) α-amilasi : agisce in modo casuale su amido, glicogeno e molecole ad esse correlate. L’α-amilasi viene secreta dalle ghiandole salivari e dal pancreas (Fig.13).  Gli esseri umani ingeriscono più della metà dei carboidrati sotto forma di amido di cui ne esistono due forme: l’amilosio, un tipo di amido non ramificato costituito da residui di glucosio legati da legami α-1,4 e l’amilopectina una forma ramificata con un legame α-1,6 ogni 30 legami α-1,6.

(Fig. 13) Struttura tridimensionale della alfa-amilasi

Quindi una molecola molto simile al glicogeno ma con minor numero di ramificazioni sia l’amilopectina che l’amilosio sono facilemente idrolizzati dall’α-amilasi una endoglicosidasi appartenente alla classe delle idrolasi che idrolizza i legami α-1,4 interni formando maltosio, maltotrioso e α- destrina.  Il maltosio è costituito da due unità di glucosio legate da un legame α-1,4.  Il maltotrioso contiene tre di queste unità mentre l’α-destrina contiene numerose unità di glucosio legate da un legame α-1,6 oltre agli altri legami α-1,4.  Il maltosio e il maltotrioso sono idrolizzati a glucosio dalla maltasi mentre l’α-destrina viene idrolizzata a glucosio dalla α-destrinasi.

b) β-amilasi: fanno parte del gruppo delle esoamilasi, a cui appartengono anche le glucoamilasi (o γ-amilasi) mentre le α-amilasi sono invece dette endoamilasi. Le beta-amilasi sono più selettive rispetto alle α-amilasi in quanto idrolizzano l’amido in maltosio rimuovendo sequenzialmente le unità disaccaridiche dall’estremità non riducente.

Gli enzimi non solo hanno notevole interesse per la biologia ma anche per la medicina e l’industria chimica e in altre applicazioni industriali che richiedono catalizzatori estremamente specifici.   Ad esempio, per la determinazione specifica di particolari composti vengono usati molto spesso nei laboratori clinici kit diagnostici con specifici enzimi (test ELISA). Alcuni preparati medicinali costituiti da enzimi sono utilizzati nella cura delle malattie da accumulo lisosomiale (malattia di Fabry, la mucopolisaccaridosi tipo I, la malattia di Pompe e la malattia di Niemann Pick tipo B).   Altri come i sulfamidici agiscono invece efficacemente nel trattamento di infezioni batteriche in quanto inibitori competitivi dell’enzima diidropteroato sintetasi o DHPS batterica , enzima chiave per la biosintesi del tetraidrofolato, essenziale per la sintesi e la replicazione degli acidi nucleici batterici.  Inoltre alcuni enzimi vengono anche utilizzati nella fabbricazione di detersivi bioenzimatici come le amilasi per il lavaggio di stoviglie con macchie particolarmente resistenti di amido e derivati, alcune proteasi in una specifica isoforma in grado di funzionare all’esterno delle cellule, le lipasi per ottimizzare la rimozione di macchie di unto e grassi di vario tipo e nella produzione di biocarburanti le cellulasi utilizzate per degradare la cellulosa in zuccheri semplici utilizzabili per le fermentazioni.

Bibliografia essenziale
1.   D.J.Williams “Biochemistry “ . Gower Medical Publishing London UK.
2.   Alan Fersht “ Struttura e meccanismi d’azione degli enzimi “ Bologna, Zanichelli, 1989.
3.   Lauro Galzigna “ Elementi di enzimologia” Piccin-Nuova Libraria, 1996.

Una delle maggiori sfide nella chimica di tutti i tempi è la possibilità di dare un’identità precisa e univoca a tutte le sostanze.   Il chimico, nella vita di tutti i giorni, osserva, studia, analizza o sintetizza molecole di ogni tipo, più o meno complesse.   Fare la carta d’identità di una sostanza, di qualsiasi tipo essa sia, non è cosa da poco, ma rappresenta al giorno d’oggi una risorsa preziosissima nello studio di tutto ciò che ci circonda.   E non solo.   Medicina, chimica, biologia e fisica sono mondi strettamente collegati tra loro e non vi è innovazione in un campo che non possa trovare applicazione anche negli altri.   Basti pensare a tutta la strumentazione reperibile nei laboratori medici, di analisi chimica o biotecnologica, nulla di ciò esisterebbe se non fosse per le scoperte, le innovazioni e le conquiste nel campo della fisica.

NMR Bruker 600 in laboratorio

Nella moderna concezione generale della chimica, quando pensiamo ad una molecola, le immagini che si profilano davanti ai nostri occhi sono ben definite: esagoni, linee e quant’altro, ormai le formule non sono più un segreto per noi.   Pensiamo ad una sostanza, ne digitiamo il nome su internet e voilà!   Ecco servita la formula!   Facile no?   E questo vale per, ormai, la maggior parte di quello che impariamo.   Siamo talmente abituati ad avere una marea di informazioni di ogni tipo e provenienza che spesso non ci soffermiamo a pensare a come queste informazioni siano state acquisite nel tempo e con quali mezzi.
Come è possibile, per esempio, che siano state individuate, nell’ultima metà del 1900, le strutture molecolari di milioni e milioni di sostanze e che sia ormai automatico identificare e schedare una molecola nel giro di pochi minuti? Le tecniche di indagine strutturale e di studio delle proprietà chimico-fisiche nel campo chimico, biologico e medico hanno fatto e stanno tuttora facendo passi da gigante.   La possibilità di studiare sistemi dai più semplici, come le singole molecole, o più complessi, come i sistemi biologici e gli organi del corpo umano, ha rappresentato una svolta epocale nella storia dell’evoluzione tecnologica, portando a notevoli e repentini progressi in vari campi scientifici.
Una delle tecniche più quotate in questo senso, che ci permette di intuire la struttura chimica di una molecola, di disegnarne i legami e disporre gli atomi che la compongono, è la spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare.   Questa, insieme ad altre tecniche come la spettrometria di massa, è alla base della caratterizzazione strutturale di molecole organiche.   Grazie ad esse siamo in grado di dare un nome ed un volto alle sostanze che ci troviamo tra le mani, per esempio in seguito ad una sintesi o alla purificazione di una matrice di origine naturale.

Il nome così altisonante di questa tecnica, abbreviata con l’acronimo NMR, deriva dal fatto che viene sfruttata proprio una delle proprietà di base di alcuni atomi, ovvero la capacità di creare un campo magnetico attorno a sé stesso grazie alla rotazione intorno al proprio asse.

inversione di spin nucleare

La rotazione del nucleo atomico su se stesso crea quello che viene definito in fisica un momento magnetico: l’elemento più semplice avente momento magnetico nucleare, nonché il più importante, è l’idrogeno.   Proviamo a immaginare il protone di cui è composto l’atomo di idrogeno come una palla che ruota su se stessa e uniformemente carica: le porzioni infinitesime di carica generano un campo magnetico la cui entità dipende dalla loro distanza dall’asse di rotazione.   Tale rotazione viene definita come spin, o momento angolare intrinseco.   Mentre per gli oggetti macroscopici il momento angolare è associato con la massa, per lo spin quest’ultima non è richiesta: infatti, sia i fotoni, che hanno massa pari a zero, sia le particelle elementari come gli elettroni, che sono considerate puntiformi, possiedono uno spin.   Le proprietà di spin dei protoni e dei neutroni si combinano per definire lo spin totale dei nuclei, da cui deriva il loro eventuale momento magnetico.   Infatti, non tutti i nuclei atomici possiedono proprietà magnetiche, ma solo nuclei con numero atomico e/o massa atomica dispari, ovvero quando il loro numero quantico di spin I è ±1/2.

Perché è importante che un nucleo possieda proprietà magnetiche?  Perché proprio sfruttando questa proprietà è possibile far interagire il campo magnetico generato dalla particella in rotazione su sé stessa con un campo magnetico esterno, applicato in uno spazio all’interno del quale è posizionata la particella.   A dire il vero, fra gli atomi che noi conosciamo e che siamo abituati a vedere sulla tavola periodica, ben pochi possiedono questa proprietà.  Sappiamo che i nuclei degli atomi sono costituiti da protoni e neutroni, i quali hanno approssimativamente la stessa massa e, così come gli elettroni, sono situati all’interno di orbitali.

Transizione tra due stati di spin nucleare

Quando il numero di protoni o neutroni è pari gli orbitali sono pieni e, poiché sono dotati di un momento angolare, nel riempire gli orbitali possono appaiarsi (spin up-spin down, esattamente come avviene per gli elettroni) annullando la risultante; se in qualcuno di questi orbitali non c’è appaiamento completo vi sarà una risultante non nulla, condizione necessaria affinchè la particella possa generare un momento magnetico e interagire con il campo esterno. Quali nuclei sono quindi adatti ad essere studiati con questo tipo di tecnica spettroscopica?  Quello più studiato è sicuramente l’idrogeno, indicato come 1H, il cui nucleo è costituito da un solo protone.  Il secondo classificato, come importanza e rilevanza scientifica, è il carbonio-13, anche indicato come 13C: si tratta dell’isotopo meno abbondante del carbonio (lo troviamo in natura con un’abbondanza relativa dell’1,1%), costituito da 6 protoni e 7 neutroni, rispetto al più noto carbonio-12 che possiede un neutrone in meno e numero quantico di spin nullo.  Proprio così, sarebbe inutile provare a studiarlo in NMR, non è in grado di interagire con il campo magnetico esterno.   Altri nuclei molto studiati con questa tecnica sono l’azoto (14N) e il fosforo (31P).   Se ci pensiamo bene, sono tutti atomi che costituiscono lo scheletro di base delle molecole organiche e che costituiscono le molecole alla base della vita: carboidrati, proteine, grassi e non solo!

Ma andiamo avanti.   Quando il nucleo si trova in un campo magnetico esterno, il suo spin si allinea con esso, ovvero fa sì che il protone si comporti come un piccolo magnete con un polo nord ed un polo sud.   Abbiamo detto che il numero di spin può assumere 2 valori, uno positivo e uno negativo, i quali definiscono due livelli di energia, uno più basso e uno più alto: in quello ad energia più alta, il momento magnetico si oppone al campo esterno, in quello ad energia più bassa, momento e campo sono allineati.   L’assorbimento di un fotone, di una radiazione è in grado di indurre una transizione tra i due stati energetici di una particella facendola passare dallo stato di bassa energia allo stato a più alta energia.   Ovviamente il contenuto energetico di questo fotone deve essere esattamente pari alla differenza di energia tra i due stati.   Qual’è l’entità di questa energia?
La meccanica quantistica ci insegna che l’energia E di un fotone è correlata alla sua frequenza ν grazie alla seguente equazione
E = h ν
in cui h rappresenta la costante di Plank.
La frequenza ν, a sua volta, oltre che dall’intensità di campo magnetico, indicata con B, dipende dal rapporto giromagnetico γ della particella.   Il rapporto giromagnetico, che differisce da nucleo a nucleo, indica la frequenza con cui un nucleo si muove attorno ad un campo magnetico esterno; il valore di questo rapporto è positivo se momento magnetico e momento angolare sono paralleli, negativo se sono antiparalleli.
ν = γ Bo
Ad esempio, per l’idrogeno, γ = 42.58 MHz / T.

In definitiva, l’energia di cui il fotone ha bisogno per provocare una transizione tra i due stati dello spin può essere espressa così:
E = h γ Bo
Questa equazione viene definita come condizione di risonanza, ovvero la condizione necessaria affinchè avvenga una transizione tra i 2 stati di spin; la frequenza di irradiazione viene definita, di conseguenza,
frequenza di risonanza o, in gergo, frequenza di Larmor.

QUANDO L’ATOMO FA PARTE DI UNA MOLECOLA: L’INFLUENZA DELL’INTORNO CHIMICO NELL’NMR

Ma perché è importante l’interazione con un campo magnetico per ottenere informazioni strutturali?
Nuclei diversi immersi in un campo magnetico interagiranno con questo in maniera diversa, fornendo, di conseguenza, segnali diversi.
Ma facciamo un passo indietro.

schema concettuale NMR

Per fare un esperimento di questo tipo abbiamo bisogno di due risorse fondamentali: un campo magnetico e una fonte di radiazioni.  All’interno del campo magnetico dovremo poi immergere, letteralmente, la nostra particella, molecola, composto di cui desideriamo ottenere informazioni strutturali.  Ci sono due modalità per condurre l’esperimento: la modalità ad onda continua, ormai superata dalla più recente modalità a impulsi, prevede che un magnete generi il campo magnetico necessario ad indurre l’intervallo tra i livelli energetici degli atomi attivi nel campione in esame, mentre, contemporaneamente, un emettitore di onde lo bombarda ad una frequenza ben precisa.  Il campo magnetico viene quindi aumentato un po’ alla volta e, come in tutte le tecniche spettroscopiche, un rivelatore registra l’assorbanza del campione ad ogni intensità di campo, ovvero quanta parte della radiazione incidente si perde al passaggio attraverso il campione.   Dato che la frequenza di risonanza di un nucleo attivo è direttamente proporzionale al campo applicato, mano a mano che il campo aumenta crescono anche le frequenze di risonanza; quando le frequenze di risonanza diventano pari a quella incidente, tutti gli atomi capaci di farlo assorbiranno quanti di energia, e l’assorbanza misurata sarà più alta.   La seconda modalità, invece, utilizzata dagli spettrometri più moderni, consiste nel mantenere costante il valore del campo magnetico aumentando, invece, la frequenza della radiazione incidente.   Il risultato non cambia, si ottiene sempre un grafico con l’assorbanza sull’asse delle y, ed una quantità utile a definire l’energia fornita sull’asse delle x.

diversi intorni chimici per atomi di carbonio

Ma stando a quanto detto finora, se tutti i nuclei attivi magneticamente entrano in risonanza allo stesso modo e tutti gli isotopi uguali si comportano allo stesso modo dando luogo ad un assorbimento di energia della stessa entità, come è possibile distinguere tra loro i nuclei in modo da correlare ogni segnale ad una data posizione nella struttura della molecola? I modelli di comportamento fisico delle particelle vengono descritti assumendo che questa si trovi nel vuoto in assenza di forze di ogni genere che agiscano su di essa, determinando in questo modo un comportamento ideale.  Se così fosse, dal nostro esperimento non otterremmo alcuna informazione utile sulla struttura del nostro campione.   Fortunatamente, i comportamenti ideali difficilmente si verificano, pertanto l’idea che una particella non sia influenzata dal suo ambiente circostante trova poco spazio nella realtà dei fatti.   Ed è proprio questa influenza a darci le informazioni che ci servono!  I nuclei, infatti, sono dotati di un intorno chimico, costituito da altri atomi e/o altre molecole che li circondano con le relative nubi elettroniche, ed essi stessi sono circondati dalla propria “nube” di particelle cariche in moto.
Il campo magnetico applicato induce, pertanto, sull’intorno elettronico di ogni nucleo, un campo magnetico locale opposto.   La nube elettronica provoca una modificazione locale del campo applicato che viene definita schermatura.  A questo punto il campo effettivo risultante viene indicato con l’equazione seguente, dove σ indica l’entità della schermatura elettronica:

Blocale = B0(1-σ)

Se riprendiamo l’equazione della frequenza di risonanza e la integriamo con questa, emerge che, a seconda dell’intorno chimico in cui è immerso un certo nucleo, la frequenza di risonanza può risultare più bassa di un fattore (1-σ) , poiché il campo magnetico indotto è opposto a quello applicato:

ν = γ B0(1-σ) / 2π

Ciò si traduce in una differente posizione dei picchi di assorbimento a seconda proprio dell’intorno chimico: osservando lo spettro è possibile fare considerazioni sullo schermo elettronico associato ai vari nuclei che li hanno generati.

tetrametilsilano (TMS)

Ecco quindi che si parla di spostamento chimico dei nuclei.  Ma spostamento rispetto a cosa?
Come in ogni tecnica di indagine è necessario effettuare un’analisi confrontando il dato ottenuto con uno standard.   Lo spostamento chimico si ricava mettendo in relazione gli schermaggi dei vari nuclei con nell’NMR del C-13 e del protone si usa il tetrametilsilano (in gergo, TMS).
A questo punto occorre specificare che gli atomi possono comportarsi reciprocamente in due modi diversi, ovvero schermando e deschermando; nel primo caso, si tratta di atomi elettron-donatori, ovvero atomi che tendono ad estendere la propria nube elettronica agli atomi adiacenti, nel secondo caso di atomi elettron-attrattori, che al contrario attraggono la nube elettronica lasciando i nuclei vicini meno schermati.
Tanto più grande è la densità elettronica, tanto maggiore sarà l’entità della schermatura.   Di conseguenza, i nuclei che si trovano in un intorno ricco di elettroni risentiranno di un campo magnetico più basso e subiranno la transizione ad una frequenza più bassa rispetto ai nuclei situati in un intorno povero di elettroni.
L’atomo di silicio, che è elettron-donatore, è il meno elettronegativo dei tre elementi che costituiscono il TMS, infatti carbonio ed idrogeno sono altamente schermati.  Inoltre, per ragioni di simmetria della molecola, tutti gli atomi di carbonio e tutti gli atomi di idrogeno sono schermati nella stessa misura, quindi si avrà un segnale unico che viene preso come 0 della scala.   Generalmente, protoni o carboni adiacenti ad atomi elettronegativi risultano deschermati, ovvero risentono di un campo magnetico applicato più intenso e subiscono transizione a frequenze più alte, quindi nello spettro si trovano ad uno spostamento chimico più alto.   Per avere una misura dello spostamento chimico che sia indipendente dal campo magnetico applicato di utilizza lo spostamento chimico relativo, misurato in ppm (Hz/MHz) ed indicato con la lettera δ.   Per convenzione, sia per 1H-NMR che per 13C-NMR, lo zero della scala è attribuito all’assorbimento all’NMR del TMS nel quale i carboni e i protoni sono più fortemente schermati di quanto si osserva nella maggior parte delle altre molecole organiche.   Per 1H-NMR, la scala d generalmente si estende da 0 a 12 ppm, mentre per 13C-NMR è molto più ampia e copre l’intervallo 0-220 ppm.

spettro NMR dell’isopropanolo

In base allo spostamento chimico è possibile distinguere, per esempio nel caso del protone, a quale gruppo funzionale appartiene un determinato H, e, in base al tipo di segnale, multiplo o singolo, è possibile determinare se è legato ad un determinato atomo singolarmente o è circondato da altri atomi di H con cui può accoppiarsi.   Di conseguenza ciò permette di ottenere una serie di importantissime informazioni strutturali e sull’intorno del tipo di nucleo che stiamo studiando.
Inoltre, è possibile ricavare informazioni quantitative grazie al fatto che il segnale che ci viene fornito dall’elaborazione dei dati ottenuti è rappresentato da un picco, la cui area è proporzionale all’entità dell’assorbanza; pertanto, calcolando tale area in riferimento ad un segnale noto, siamo in grado di risalire al numero di nuclei relativi a quel dato segnale.

C’è un altro fattore che dobbiamo considerare prima di avventurarci nel magico mondo della spettroscopia NMR.   Se osserviamo uno spettro noteremo subito che il numero dei picchi supera di gran lunga il numero dei nuclei presenti nella nostra molecola.   Com’è possibile?   Grazie al fenomeno dell’accoppiamento spin-spin.   Un protone risente del campo magnetico posto intorno a lui e, a seconda che nel suo intorno vi siano 0,1,2,3 o più protoni cambierà notevolmente l’entità del campo magnetico da lui risentito.   Il risultato è che, in base a tutte le possibili combinazioni di orientamento del campo esterno applicato e indotto dai nuclei e al numero di protoni che interagiscono tra loro, l’entità e l’identità del segnale varieranno dando luogo ad un numero di picchi differente.   Questo aspetto è di fondamentale importanza nell’interpretazione di uno spettro NMR, a prescindere dal tipo di nucleo di cui si parla.

LO SPETTROMETRO NMR

Ma come è fatto uno spettrometro per risonanza magnetica nucleare?
Come abbiamo detto qualche riga fa, i due componenti fondamentali che costituiscono questo strumento sono la sorgente di campo magnetico e il generatore di radiazioni, corredati ovviamente dal sistema di acquisizione ed elaborazione dati.   In passato, quando i campi magnetici non prodotti da elettromagneti non erano molto diffusi e la superconduttività, ancora sperimentale, si affacciava nel mondo scientifico con strumenti non ancora commerciali, venivano largamente usati i magneti permanenti.

radiofrequenza e campo magnetico in uno spettrometro NMR

Al giorno d’oggi, invece, i superconduttori rappresentano la frontiera tecnologica più avanzata nel campo della spettroscopia NMR.   L’uso dei superconduttori permette, infatti, di poter disporre di campi magnetici sempre più intensi e di strumenti di conseguenza più potenti e ciò, di pari passo con una dotazione elettronica sempre più all’avanguardia, ha consentito lo studio strutturale anche di molecole che con i vecchi spettrometri sarebbe stato arduo analizzare.
I campi magnetici, infatti, possono essere prodotti anche da elettromagneti e superconduttori.   Gli elettromagneti sfruttano il passaggio di corrente in un conduttore il quale, quando è percorso da cariche elettriche in moto, produce un campo elettrico indotto ma anche un campo magnetico esterno, proporzionale alla quantità di cariche che fluiscono.  Questi magneti producono campi relativamente modesti che però necessitano dell’erogazione di una grande quantità di energia elettrica e, per il conseguente effetto Joule prodotto, anche di un efficace sistema di raffreddamento. solitamente ad acqua, per dissipare il calore prodotto dalla grande quantità di cariche in movimento.  Questo ha prodotto la necessità di pensare ad una valida alternativa, ovvero un materiale in grado di condurre l’elettricità creando campi magnetici elevati ma che allo stesso tempo non comporti un surriscaldamento della struttura.   Per un metallo alle temperature ordinarie, la conducibilità elettrica è inversamente proporzionale alla temperatura assoluta.   Gli atomi del conduttore metallico formano un reticolo che vibra quanto più è alta la temperatura del conduttore stesso.   Gli elettroni, che si muovono attraverso il reticolo, non procedono in linea retta a causa delle collisioni che avvengono tra loro quindi perdono energia sotto forma di calore.  I superconduttori, come gli elettromagneti, sono considerati tra i materiali resistivi ma, in realtà, è proprio la loro capacità di non opporsi al passaggio della corrente elettrica che li rende tali.
Il generatore di campo magnetico degli strumenti più moderni, pertanto, è costituito da una bobina di un materiale superconduttore, spesso rappresentato da una lega metallica di niobio e titanio, che a bassissime temperature (-270° C!) non oppone alcuna resistenza alla corrente, perciò questa continua a girare nella bobina senza richiedere di essere alimentata; si definiscono criomagneti.

refill di azoto liquido in un NMR

Ma come è possibile raggiungere tali temperature?  Grazie all’ausilio di liquidi refrigeranti come l’elio e l’azoto.   La bobina è immersa in una specie di vaso cilindrico, detto dewar, interno allo spettrometro che viene riempito di elio liquido; nonostante lo strumento sia ben isolato, la temperatura esterna molto più elevata rispetto a quella interna provoca una considerevole evaporazione del liquido, il cui livello tende ad abbassarsi gradualmente. Per rallentare il più possibile questo processo di evaporazione viene introdotto all’interno dello strumento, in un dewar esterno ed adiacente a quello contenente l’elio, anche l’azoto liquido che, fornendo una temperatura di -79°C, mantiene l’elio allo stato liquido. Ovviamente l’azoto evapora molto più in fretta rispetto all’elio, quindi, se per quest’ultimo i tempi di esaurimento e rifornimento sono molto più dilazionati, per l’azoto è necessario effettuare il refilling con una frequenza decisamente maggiore, in funzione anche delle dimensioni dello strumento.
Le unità di misura che indicano il flusso di un campo magnetico sono i Gauss ed i Tesla; è ormai entrata nella terminologia di uso comune l’abitudine di indicare la grandezza di un magnete, e quindi il campo magnetico da esso prodotto, facendo riferimento alla frequenza di risonanza del protone.  Pertanto se si parla di un magnete da 90 MHz si vuole indicare un campo magnetico da 2,11 Tesla nel quale il protone risuona appunto a 90MHz. Negli ultimi anni il progresso tecnologico ha portato alla costruzione di strumenti che arrivano ai 100 MHz di un elettromagnete e ai 900 MHz – 1 GHz di un criomagnete.

FID (Free Induction Decay)

Occupiamoci ora della sorgente di radiazioni.  Nei primi strumenti l’analisi veniva eseguita irradiando il campione immerso nel campo magnetico con un fascio di onde radio di frequenza via via crescente in modo da eccitare in sequenza tutti i nuclei in esame e veniva registrata l’entità della radiazione assorbita.  Questa tecnica, però, risultava molto lenta e oggi non viene più utilizzata. Nei moderni strumenti, invece, il segnale viene generato con il metodo ad impulso e la trasformata di Fourier; in questo modo tutti i nuclei di una specie vengono eccitati contemporaneamente da un impulso che con  tiene tutto l’intervallo di frequenze necessario e i dati vengono poi elaborati al computer con la tecnica della trasformata di Fourier.  In cosa consiste?  Il segnale ottenuto sarebbe un segnale oscillante con frequenza ν, la frequenza di Larmor del nucleo in esame, che si smorza nel tempo e che viene definito FID (Free Induction Decay), libero decadimento dell’induzione; questo accade perché quando si interrompe l’impulso di radiofrequenza i nuclei eccitati continuano ad emettere per qualche istante un debole segnale di radiofrequenza che si spegne nel tempo, una specie di eco del segnale assorbito.  Il segnale che noi vedremmo sarebbe una misura dell’intensità dell’energia trasmessa in funzione del tempo; ma per avere un’informazione utile ed elaborabile ci serve trasformare questi dati ottenendo un’espressione dell’intensità in funzione della frequenza.

GLI SPETTRI NMR

La trasformata di Fourier non è altro che un’operazione matematica che ci permette di scomporre e successivamente ricombinare un segnale generico in una somma infinita di sinusoidi con frequenze, ampiezze e fasi diverse ottenendo così l’insieme di valori in funzione della frequenza.

Quindi, se reduci da un’intensa attività di laboratorio volessimo analizzare il frutto del nostro lavoro?
Dobbiamo tenere conto ancora di qualche accorgimento.  Per una buona riuscita della nostra analisi è necessario ottenere una buona risoluzione, caratteristica comune a tutte le tecniche analitiche.

tubo per NMR

Per fare questo occorre che i segnali del nostro spettro, rappresentati da picchi, risultino stretti e assomiglino il più possibile a righe.  E’ necessario, pertanto, che il campo magnetico attorno al campione sia il più possibile omogeneo.  Il campione viene inserito in un tubicino del diametro di 5mm e lungo circa 20cm, disciolto in un opportuno solvente che presenta la caratteristica peculiare di essere “deuterato”: gli atomi di idrogeno che costituiscono la molecola vengono sostituiti da atomi di deuterio, isotopo dell’idrogeno con peso atomico pari a 2.  Perché?  Se vogliamo registrare lo spettro NMR dei protoni presenti nel nostro campione dobbiamo essere sicuri che i segnali rilevati siano relativi esclusivamente a loro, pertanto dobbiamo escludere qualsiasi altra fonte di protoni, come appunto il solvente.  I solventi utilizzati sono in genere deuterati (CDCl3, CD3COCD3), in quanto, oltre al fatto che il nucleo più indagato è senza dubbio 1H, per cui è necessario evitare solventi contenenti idrogeni per non avere nello spettro grossi segnali dovuti al solvente, il segnale del deuterio viene utilizzato dallo strumento per effettuare una serie di operazioni automatiche che garantiscono la stabilità del campo magnetico applicato e dall’operatore per valutare l’omogeneità del campo stesso.

sezione di uno spettrometro NMR

Il campione viene introdotto da una apertura nella parte superiore e calato all’interno del magnete grazie ad un flusso di aria compressa che lo mantiene in galleggiamento fino al raggiungimento della posizione ottimale. Se il flusso di campo che investe la porzione di liquido analizzato non è omogeneo, accade che nuclei posti in posizioni diverse del campione risentano di diversi valori di campo e daranno, di conseguenza, risonanza a frequenze diverse.  Risultato?  La somma di tutte le diverse risonanze darà origine ad una banda allargata.  Se, al contrario, il campo è omogeneo, tutti i nuclei risentono dello stesso flusso di campo e risuoneranno quindi alla stessa frequenza producendo un segnale stretto.  Per ottenere l’omogeneità del campo vengono svolte, simultaneamente, due azioni, chiamate in gergo lock e shim.
Il lock, o rotazione del campione, permette di “sistemare” il campione nello spazio in cui è presente il campo magnetico e regolare le posizioni dei vari nuclei, mentre lo shim è un’operazione che prende il nome dalle “shimming coils”, una serie di spirali poste intorno al sistema di analisi che producono piccoli campi magnetici di intensità e direzione regolabile.  Entrambe le operazioni di aggiustamento di questi campi vengono eseguite per ogni campione all’inizio di ogni analisi e sono fondamentali per ottenere un buon risultato.
Come dicevamo all’inizio, i nuclei che si possono indagare sono diversi a seconda delle informazioni che si vogliono ottenere; in chimica organica, dove questa tecnica è usata prevalentemente per confermare o determinare strutture semplici di molecole non troppo grandi, i nuclei di interesse sono rappresentati da 1H e 13C. A questo proposito, vi è una differenza a livello operativo fra questi due esperimenti, dovuta al fatto che se si intende registrare uno spettro al protone si possono utilizzare soluzioni molto diluite, poiché grazie alla elevata sensibilità del protone e soprattutto alla sua elevata abbondanza isotopica, il segnale di risonanza prodotto sarà comunque molto intenso; al contrario, se vogliamo registrare uno spettro del 13C, che ha un’abbondanza naturale dell’1,1%, sarà necessario utilizzare soluzioni molto più concentrate.

Questa tecnica, alla luce di quanto detto, ci offre un panorama di possibilità non indifferente; la chimica, intesa come scienza degli atomi, delle molecole e delle innumerevoli combinazioni in cui essi si articolano, non è che uno dei possibili campi di applicazione.  Se pensiamo che noi stessi, intesi come organismi viventi, non siamo altro che una struttura complessa e ben concertata di cui atomi e molecole rappresentano i costituenti principali, i piccoli mattoncini che si organizzano a loro volta in strutture via via più complesse, non diventa difficile immaginare come la spettroscopia NMR possa fornire buoni risultati anche nello studio delle macromolecole, degli organi e del corpo umano.  Proprio così, medicina e chimica sono due risvolti della stessa medaglia, possono affrontare le stesse problematiche a due livelli differenti, microscopico l’una e macroscopico l’altra.

Negli organismi viventi a partire dagli invertebrati, l’evoluzione ha selezionato dei recettori chiamati PRR (Pattern Recognition Receptors) in grado di riconoscere un ampio spettro di motivi strutturali associati ai patogeni relativamente costanti e indispensabili alla sopravvivenza di questi microorganismi.
[per chi sentisse da necessità di un'introduzione preliminare all'immunochimica, consigliamo dello stesso Autore: "Gli anticorpi: un esercito che ci difende dagli invasori"]

(Fig. 1) – Struttura del lipopolisaccaride batterico o LPS

Le strutture molecolari riconosciute dai PRR sono denominate PAMP dalla dizione anglosassone “Pathogen Associated Molecular Pattern” e rappresentano i lipopolisaccaridi (LPS) sui batteri Gram negativi (Fig.1) e gli acidi teicoici sui batteri Gram positivi , i peptidi formilati che contengono all’estremità N –terminale una formilmetionina, i peptidoglicani e i flagelli dei batteri (Fig.2), gli RNA a singolo e a doppio filamento virali, le sequenze CpG non metilate ( regioni genomiche che contengono un’elevata densità di siti CpG dove la “p” nella notazione CpG si riferisce al legame fosfodiesterico tra la citosina e la guanina) in alcuni batteri o ancora i mannani cioè composti glucidici a base di mannosio dei funghi e dei lieviti (Fig. 3)

Fig. 1 – Struttura del lipopolisaccaride batterico o LPS  : uno dei componenti della parete cellulare esterna dei batteri Gram-negativi. In generale,  gli LPS sono costituiti da tre regioni principali: a) una porzione glicolipidica chiamata Lipide A; b) un core oligosaccaridico;c) una O-Specific Chain, ossia una catena polisaccaridica costituita da 20-50 unità ripetitive che generalmente possono contenere fino ad otto carboidrati.

(Fig. 2) – Unità ripetitiva del peptidoglicano

Fig. 2 – Il peptidoglicano è un polimero, che costituisce uno strato nella parete cellulare dei batteri Gram positivi ma anche dei Gram negativi ed è il principale responsabile della rigidità della cellula. Strutturalmente è costituito da una ripetizione di lamine sottili composte di glican-tetrapeptide legate insieme da legami crociati tetrapeptidici traamminoacidi delle unità adiacenti. Il glican-tetrapeptide è frutto di due derivati polisaccaridici, l’N-acetilglucosammina e l’acido N-acetilmuramico e da un piccolo gruppo di amminoacidi.

Negli esseri umani esistono due sistemi che contribuiscono all’immunità: il sistema immunitario innato o aspecifico e il sistema adattativo o specifico suddiviso in umorale e in cellulo-mediato. Entrambi questi sistemi sono essenziali per la sopravvivenza della specie.
Il primo è costituito da un grande numero di cellule specializzate come i neutrofili , i macrofagi, le cellule di Langerhans, le cellule natural killer o NK, le cellule dendritiche o DC che svolgono il compito elementare di monitorare la presenza di invasori attraverso un sistema di riconoscimento (PRR) di strutture essenziali dei microorganismi estranei come i componenti delle pareti batteriche (PAMP) ma assenti nell’ospite.  Il riconoscimento di patogeni come batteri ed elminti che non è specifico da parte di queste cellule, attiva dei sistemi di uccisione rapida che sono costituiti da intermedi reattivi dell’ossigeno (meccanismi di uccisione ossigeno dipendenti come i radicali idrossilici , l’ossigeno singoletto e il perossido di idrogeno e non dipendenti come il lisozima ed enzimi idrolitici che non coinvolgono l’ossigeno) oppure composti dell’azoto ( ossido nitrico o NO) o ancora costituiti da peptidi antimicrobici e citotossici.  Inoltre tale riconoscimento induce la produzione di citochine infiammatorie (proteine prodotte dai linfociti T e B e dai macrofagi con funzione immunoregolatrice cioè attraverso il legame a specifici recettori espressi sulla superficie cellulare regolano e coordinano la risposta immunitaria) come IL- 1 e TNF α e β e di chemochine (peptidi di 70 – 80 amminoacidi che regolano l’attivazione di molecole di adesione o integrine sulla superficie dei leucociti) che reclutano i leucociti e aumentano la risposta infiammatoria amplificando così i meccanismi di resistenza innata.

(Fig. 3) – Mannosio

Accanto a questi composti chimici altri componenti umorali dell’immunità innata sono rappresentati dalla lectina che lega il mannosio (MBL), dai surfactanti A e D (SP-A e SP-D), dalle pentrassine (proteine pentameriche costituite ognuna da 5 subunità monomeriche identiche associate ad ione Ca⁺⁺, che si legano tra loro a formare una struttura pentagonale) quali la Proteina C reattiva e il PTX3 e dalle proteine che accompagnano il sistema del Complemento.  Queste molecole precedono nell’evoluzione gli anticorpi dell’immunità adattativa.
I componenti sia cellulari che solubili possono essere attivati entro pochi minuti o alcune ore dall’inizio di una infezione e questa risposta rapida risulta indispensabile per la sopravvivenza in quanto sono necessari molti giorni affinché i componenti del sistema adattativo entrino in funzione.
Il secondo sistema immunitario cioè quello adattativo è fondato sulla generazione di recettori specifici costituiti dagli anticorpi per i linfociti B e dal recettore per i linfociti T o TCR. Ogni cellula porta un unico recettore ed è l’incontro con l’antigene (sostanza estranea all’organismo o immunogeno) che seleziona la cellula più adatta in grado di firnire una risposta efficace.   I linfociti T rappresentano gli elementi cellulari centrali nella risposta immunitaria adattativa per la discriminazione del self dal non self.   Essi, con il riconoscimento dell’antigene fanno partire una risposta immunitaria specifica aiutando i linfociti B nella produzione di anticorpi ma facendo anche aumentare la capacità delle cellule dell’immunità innata a distruggere i microorganismi patogeni.   La percezione del mondo esterno da parte dei linfociti T passa attraverso il riconoscimento del self.   Il TCR vede l’antigene cioè il mondo esterno solo se presentato dalle APC nel contesto dell’MHC (Major Histocompatibility Complex).   L’MHC costituisce una specie di identità immunologica dell’individuo e la sua funzione è quella di legare e presentare in maniera adatta frammenti (peptidi) al TCR dei linfociti T.

Immunità innata – PRR e PAMP

Ma quali sono le cellule che hanno l’MHC e svolgono la funzione di presentarlo? Le cellule che posseggono l’MHC e svolgono la funzione di presentarlo sono costituite dalle cellule dendritiche che appartengono all’universo dell’immunità innata e non hanno recettori specifici ma solo i PRR scarsamente specifici. Sono quindi queste cellule non specifiche che decidono presentando un segnale di costimolazione se far partire la risposta immunitaria adattativa guidata dai linfociti T .
Cioè, in poche parole, paradossalmente sono gli elementi cellulari e umorali dell’immunità innata che decidono se far partire una risposta immunitaria adattativa o specifica.
Tutti i meccanismi dell’immunità adattativa sono comparsi nell’evoluzione in organismi più complessi e sono caratterizzati da una estrema specificità. Infatti, nell’immunità adattativa la risposta è mirata e altamente specifica perché punta a combattere un particolare batterio o un particolare virus e i prodotti finali sono rappresentati dagli anticorpi che neutralizzano microorganismi extracellulari e dai linfociti T che eliminano microorganismi intracellulari utilizzando un grande repertorio di recettori. In definitiva, l’immunità adattativa differisce solamente da quella innata in quanto è dotata di memoria anche se entrambe sono in grado di discriminare il self dal non self.

linfocita T – immagine al microscopio

Infatti, fino a poco tempo fa, si riteneva che i due sistemi fossero nettamente distinti cioè si pensava che l’immunità innata servisse solo ad innescare e a orientare la risposta immunitaria adattativa e che il suo ruolo si limitasse solamente a quello di una semplice linea di difesa con il compito di contenere l’infezione in attesa di reazioni specifiche e adattate assicurate dai linfociti T (immunità acquisita cellulare) o dagli anticorpi ( immunità acquisita umorale).
Successivamente si dimostrò che l’attivazione dei linfociti T richiedeva da una parte che l’antigene venisse presentato dalle molecole del complesso maggiore di istocompatibilità o MHC (Major Histocompatibility Complex o HLA nell’uomo da Human Leucocyte Antigen) e dall’altra parte che le cellule incaricate di segnalare l’antigene (macrofagi e cellule dendritiche) chiamate anche APC (Antigen presenting cell) esprimessero anch’esse sulla propria superficie delle molecole costimolatorie che avvertissero il sistema immunitario della presenza di un agente patogeno. Una volta chiarito il meccanismo per il quale le APC esprimevano molecole costimolatrici quando riconoscevano un agente patogeno, rimaneva aperta una questione molto importante: quali erano i recettori in grado di identificare elementi potenzialmente pericolosi? Dopo la scoperta del ruolo immunitario di recettori chiamati Toll nella Drosophila , molti ricercatori sono andati alla ricerca di molecole omologhe nell’uomo. Tali ricerche sono state coronate da successo dato che sono stati identificati diversi tipi di questi recettori candidati particolarmente adatti ad assumere il ruolo di recettori dell’immunità innata.
Oggi , grazie alle scoperte dei Premi Nobel Steinman, Beutler e Hoffmann di alcuni dei meccanismi che coinvolgono l’immunità innata appare sempre più chiaramente che il sistema innato e quello adattativo sono intimamente connessi e che il sistema adattativo non può manifestarsi senza essere attivato dal sistema innato.

Ralph Steinman Marvin (1943 – 2011

Ralph Steinman Marvin (1943 – 2011) : è stato immunologo e biologo cellulare canadese . Vincitore nel 2011 del Premio Nobel per la Fisiologia e la Medicina per la scoperta della cellula dendritica e del suo ruolo nel sistema immunitario adattativo insieme a Bruce Beutler e Jules A. Hoffmann per le loro scoperte riguardanti l’attivazione dell’immunità innata”.
Egli ha inoltre ricevuto altri numerosi premi e riconoscimenti per il suo lavoro sulle cellule dendritiche, come il premio Albert Lasker per la ricerca medica di base (2007), il Gairdner Foundation International Award (2003), e il Cancer Research Institute William B. Coley Award ( 1998). Inoltre, è stato nominato membro del Institute of Medicine (USA, eletto 2002) e la National Academy of Sciences(USA, eletto 2001). Negli anni ’70 capì che le cellule dotate di lunghe propaggini simili a tante braccia chiamate “ cellule dendritiche “ , avevano la funzione di campionare il mondo circostante per allertare e orientare in direzioni diverse il sistema di difesa dell’organismo umano.

Infatti, l’organismo animale possiede la capacità di proteggersi da elementi molto piccoli, come i virus, e da patogeni più grandi come gli elminti.
Quindi, era logico che occorreva utilizzare armi diverse per questi due tipi di «invasori» e le cellule dendritiche erano in grado di sollecitare differenti tipi di risposte specifiche. Le cellule dendritiche derivano da un precursore dei fagociti e sono localizzate sulla cute, all’interno dell’intestino e sulle mucose.   Praticamente sono presenti su tutte le porte di accesso al nostro corpo.

Bruce Beutler (1957 – vivente)

Bruce Beutler (1957 – vivente): immunologo statunitense, professore e direttore del centro di genetica all’University of Texas Southwestern Medical Center. Le sue scoperte, che hanno rivelato alcuni fattori essenziali delle interazioni fra l’organismo e il suo ambiente, sono risultate importanti per il futuro delle ricerche sul sistema immunitario.  Nel 2007 ha vinto con Jules Hoffmann il Premio Balzan per l’immunità innata. Nel 2011 gli è stato assegnato il Premio Nobel per la medicina insieme a Jules Hoffmann e Ralph M. Steinman.

Jules Hoffmann ( 1941 – vivente)

Jules Hoffmann (1941 – vivente): immunologo francese di origine lussemburghese.  Nel 2007 ha vinto con Bruce Beutler il Premio Balzan per l’immunità innata e nel 2011 con Bruce Beutler e Ralph Steinman il Premio Nobel per la medicina.  È la seconda persona di origine lussemburghese a vincere un Premio Nobel dopo Gabriel Lippmann, che vinse il Premio Nobel per la fisica nel 1908.

Negli anni ’90 Hoffmann mentre lavorava sui moscerini della frutta (Drosophila) cercò di capire come questi piccoli insetti combattevano le infezioni. Nei suoi studi scoprì come un gene, chiamato Toll (che in tedesco significa «fantastico, strano»), fosse essenziale per la risposta immunitaria: uno dei Toll nel moscerino è il sensore che capta la presenza di batteri nell’organismo dando luogo alla risposta immunitaria innata. Dopo pochi anni Beutler, mentre studiava nei topolini lo shock settico, scoprì che anche nei mammiferi, incluso l’uomo, esistevano dei geni simili a Toll che avevano la stessa funzione (TLR, «Toll-like receptors»). I TLR sono presenti non solo nei fagociti, ma anche in altre cellule come le cellule dell’epitelio e le cellule endoteliali, che rivesono l’interno dei vasi. Essi, oltre a riconoscere lipopolisaccaridi batterici, sono in grado di riconoscere anche il DNA batterico, e anche gli acidi ribonucleici. Il vero cambio di paradigma si è avuto quando si è capito che mammiferi e moscerini condividevano un sistema di risposta immunitaria innata molto simile: trasportare lo schema dei recettori Toll-like tra mammiferi (topo e uomo) e averne le prove era un passaggio ovviamente importante ma tutto sommato poco innovativo.

classi di recettori PRR

Il sistema dell’immunità innata riconosce i patogeni attraverso recettori oggi chiamati PRR o Pattern Recognition Receptor presenti sulle membrane cellulari di alcune cellule immunitarie (linfociti, cellule dendritiche, macrofagi, neutrofili) oltre che sulle cellule epiteliali ed endoteliali ( Toll –Lile o TLR) ma che possono essere anche solubili sia nel sangue (componenti del sistema complementare) che nei liquidi extracellulari. La loro funzione è quella di legarsi a strutture molecolari specifiche dette PAMP presenti su un’ampia varietà di virus, batteri, protozooi e funghi con cui possono iniziare la fagocitosi del patogeno e stimolare un programma di espressione genica nella cellula ospite che consiste nell’ attivare una trasduzione del segnale intracellulare che scatena una risposta effettrice che può provenire dalla cellula stessa (fagociti) o da altre cellule come le NK reclutate da mediatori chimici come le citochine.

Le principali classi di PRR associati alla cellule sono rappresentati dai recettori Toll- like o TLR di cui si conoscono differenti molecole, dalle lectine di tipo C, dai recettori Scavenger, dai Recettori 7 α-eliche, dagli NRL e dalle proteine della famiglia CARD.

Recettori Toll-like o TLR

I recettori Toll-like o TLR costituiscono la prima linea di difesa. Essi devono il loro nome al recettore Toll identificato per la prima volta nella Drosophila e rappresentano la classe principale di recettori dell’immunità innata. Nell’uomo ne sono stati identificati sinora undici, numerati da TLR1 a TLR11.
Strutturalmente sono delle proteine transmembrana che hanno un comune dominio extracellulare che consiste in una serie di ripetizioni ricche di leucina e cisteina e un dominio intracellulare che svolge un ruolo primario nella trasduzione del segnale.   I vari TLR riconoscono vari componenti microbici, fra cui LPS, peptidoglicani , nucleotidi CpG non metilati (tutte molecole presenti prevalentemente nei microrganismi), singola e doppia elica di RNA. Questi recettori, una volta attivati, stimolano la produzione di sostanze battericide.   Dopo la loro stimolazione possiamo ritrovare:  a) produzione di ossigeno nascente e intermedi dell’ossigeno; b) attivazione della cascata del complemento; c) attivazione dell’interferone; d) attivazione delle cellule natural killer; e) produzione di citochine e di chemochine; f) produzione di molecole di adesione; g) produzione delle proteine della fase acuta; h) produzione di peptidi di vario tipo.

Lectine tipo C

Le lectine di tipo C sono delle proteine transmembrana Ca⁺⁺ dipendenti che legano alcuni polisaccaridi come i β-glucani (Fig.4) molto comuni nei batteri e presenti nei macrofagi e nelle cellule dendritiche.
I β-glucani  sono dei polisaccaridi lineari costituiti da molecole di glucosio unite insieme mediante legami glicosidici β(1-3) e β(1-4). Una delle lectine di tipo C più comuni è il recettore per il mannosio di cui le pareti cellulari dei batteri sono ricche.

I Recettori Scavenger

I Recettori scavenger sono una classe di PRR espressi dalle cellule fagocitarie.   Si conoscono due famiglie di scavenger, denominate A e B.   Il tipo B è maggiornmente rappresentato ed è una glicoproteina di 88 kD, conosciuta come CD36, la quale risiede su numerosi tipi di cellule, tra cui l’endotelio e i macrofagi.   Il ruolo degli scavenger è di legare le sostanze di degradazione di accumulo metabolico tra cui LDL (Low Density Lipoprotein) e i prodotti terminali glicosilati.

(Fig. 5) – Struttura recettoti 7 alfa-eliche

Recettori 7 α- eliche

I Recettori 7 α-eliche sono composti da un’unica catena polipeptidica formata da 7 α-eliche che attraversa 7 volte la membrana plasmatica (Fig. 5).   A queste 7 α- eliche si aggiungono 6 anse idrofiliche (3 extracellulari e 3 citoplasmatiche) di collegamento fra le α -eliche.
L’estremità amino-terminale è extracellulare, quella carbossi-terminale è intracellulare.   L’ansa intracitoplasmatica che collega la 5a e la 6a elica transmembarana (cioè la 3a ansa intracellulare), insieme ad un dominio della regione C-terminale, forma il sito di legame per le proteine G.   Questa stessa ansa e la coda C-terminale, inoltre, hanno degli aminoacidi di serina e treonina che rappresentano i siti di enzimi fosforilanti importanti per la modulazione e la desensitizzazione di questi recettori.   Mediano i loro effetti attraverso l’attivazione di una proteina G, questi recettori sono espressi dai leucociti neutrofili e dai macrofagi , riconoscono batteri e alcuni mediatori prodotti in risposta alle infezioni.
I recettori di questa classe riconoscono piccoli peptidi che contengono residui N-formil-metioninici.  Poiché tutte le proteine batteriche iniziano con N-formil-metionina, questo recettore consente ai neutrofili di riconoscere e rispondere alle proteine batteriche.

Recettori NLR

I Recettori NLR sono proteine citoplasmatiche che riconoscono specifiche molecole batteriche come il peptidoglicano. In risposta a tale riconoscimento scatenano la trasduzione del segnale che mediante una cascata di proteine attiva dei fattori trascrizionali come NF – kB i quali trascrivono geni coinvolti nelle risposte infiammatorie e nell’apoptosi. . I più noti sono i Recettori NOD (Nucleotide binding Domain) come NOD1,NOD2,NOD3 e i Recettori NALP ( NACHT –LRR and pyrin domain containing Proteins) come NALP1,NALP2 e NALP3.

Recettori CARD

I Recettori CARD sono dei recettori citoplasmatici che contengono il dominio CARD che riconoscono l’RNA virale . Attivano la trasduzione del segnale che porta all’attivazione del fatoore trascizionale NF – kB e dunque alla produzione di citochine come gli interferoni. I più noti recettori sono rappresentati da RIG-1 e MDA5.

[per chi sentisse da necessità di un'introduzione preliminare all'immunochimica, consigliamo dello stesso Autore: "Gli anticorpi: un esercito che ci difende dagli invasori"]

Bibliografia essenziale

Du X, Poltorak A, Wei Y, Beutler B . “Three novel mammalian toll-like receptors: gene structure, expression, and evolution”. Eur. Cytokine Netw. 2000, 11, 362.

Ferrandon D, Imler JL, Hetru C, Hoffmann JA . The Drosophila systemic immune response: sensing and signalling during bacterial and fungal infections.Nat Rev Immunol 2007, 7 , 862.

forma degli orbitali elettronici (s, p, d, f) dell’atomo isolato

Possiamo tentare di spiegarla in questo modo:
Nell’atto di stabilire legami chimici con altri atomi è particolarmente frequente che gli orbitali facenti parte del guscio elettronico più esterno di un atomo, molto simili fra loro dal punti di vista energetico ma diversi per geometria e per disposizione spaziale, si “combinino” fra loro con un processo noto come ibridizzazione – o ibridazione elettronica – restituendo un pari numero di orbitali atomici, questi detti ibridi, identici fra loro sia dal punto di vista energetico che della forma, molto ben direzionati nello spazio ed orientati a massimizzare la divergenza angolare reciproca all’interno dello spazio bi- o tridimensionale a loro disposizione.   Il vantaggio energetico conseguente allo stabilirsi del legame chimico compenserà ampiamente la piccola promozione della quale possono godere talvolta alcuni elettroni per entrare a far parte degli orbitali ibridi, mentre la direzionalità specifica di tali orbitali costituisce un presupposto fondamentale per le caratteristiche geometriche e strutturali delle molecole che si formeranno, fino a rendere le stesse strutture molto meno “fluide” di quanto si sarebbe potuto immaginare in assenza del fenomeno dell’ibridizzazione.

1)  (condizione) Gli orbitali atomici per combinarsi recirpocamente devono essere energeticamente simili fra loro.  Questo significa in pratica che l’ibridizzazione può riguardare solo gli orbitali dello stesso livello energetico, ovvero con lo stesso numero quantico principale.

2) (condizione) L’atomo è impegnato a formare legami chimici con altri.  In pratica l’ibridizzazione degli orbitali atomici riguarda i singoli atomi “in occasione” dell’instaurarsi di un legame chimico, e non atomi a sé stanti in forma non legata.

3) (conseguenza) Gli orbitali atomici di partenza sono sostituiti da un numero di orbitali (detti “ibridi”) numericamente uguale a quello degli orbitali che si sono combinati nell’ibridizzazione.

4) (conseguenza) Gli orbitali atomici formati – detti orbitali ibridi – sono fra loro identici per energia, intermedia rispetto a quella degli orbitali atomici che si sono fra loro combinati.

5) (conseguenza) Gli orbitali ibridi formati sono fra loro identici per forma, comunque più affusolata (ovvero maggiormente direzionati) rispetto agli orbitali di partenza.

6) (conseguenza) Gli orbitali ibridi formati sono disposti fra loro nello spazio tridimensionale secondo un criterio di ottimizzazione della loro divergenza angolare. Uno o più orbitali ibridi possono essere occupati da doppietti elettronici invece di partecipare attivamente ai legami molecolari.

7) (nota) L’ibridizzazione non è un fenomeno fisico ma una sorta di combinazione matematica… tra le funzioni d’onda che descrivono gli orbitali.

8) (nota) All’atto pratico, gli atomi che concorrono alla formazione di legami chimici – per lo meno a quelli covalenti – lo fanno tramite orbitali ibridi che coinvolgono tutti i in parte gli orbitali elettronici del livello elettronico più esterno.

9) (nota) L’ibridizzazione degli orbitali è parte integrante della teoria del Legame di Valenza e non viene considerata in contrapposizione con altre teorie pure in auge su argomenti analoghi (es. VSEPR e Teoria degli Orbitali Molecolari).

10) (applicazione) Si tratta di uno dei “metodi migliori attualmente disponibili” per rendere conto della direzionalità dei legami chimici e quindi della struttura delle molecole.

Clicca qui per vedere il video incorporato.

GLI ORBITALI IBRIDI DEL CARBONIO

Il fatto che l’ibridizzazione degli orbitali elettronici venga insegnata solitamente prendendo come esempio dell’atomo di carbonio non significa affatto che questo fenomeno non accada o abbia importanza minore per gli altri elementi.

Le ragioni per le quali il carbonio è certamente un buon esempio sono soprattutto tre:
- Si tratta di uno dei primi elementi della tavola periodica, uno dei più semplici;
- In esso si assiste anche ad un fenomeno collaterale, che spesso accompagna l’ibridizzazione degli orbitali: quello della promozione energetica di un elettrone dalle sue condizioni precedenti;
- La comprensione della chimica dei composti del carbonio, ovvero della chimica organica, ricava certamente grande beneficio dalla comprensione di una plausibile spiegazione della direzionalità dei legami, possibile previo ibridizzazione degli orbitali atomici dello stesso carbonio.

Come abbiamo detto l’ibridizzazione coinvolge orbitali energeticamente molto simili fra loro, quindi dello stello livello energetico – o con lo stesso numero quantico principale: dei 6 elettroni posseduti dall’atomo di carbonio isolato non consideriamo quindi i primi due, che occupano l’orbitale 1s ma ci concentreremo sui 4 rimanenti che occupano gli orbitali elettronici del livello 2.
Nel 2° livello i 4 elettroni non si trovano tuttavia uniformemente distribuiti fra i 4 orbitali possibili, ovvero il 2s ed i tre 2p diretti secondo le 3 coordinate spaziali (px, py, pz), bensì iniziano a riempire il sottolivello ad energia inferiore, quindi il 2s.
Nella figura a lato è rappresentata la configurazione elettronica del carbonio elementare allo stato atomico ed isolato.
Per poter ibridizzare i suoi orbitali elettronici 2s e 2p, uno degli elettroni presenti in coppia nel 2s dev’essere promosso a 2p: in questo modo si avrà una quaterna di orbitali (2s, 2px, 2py, 2pz) ciascuno occupato da un solo elettrone, che potranno fondersi reciprocamente restituendo 4 orbitali veramente identici per energia e per forma.   Non essendoci ulteriori elettroni nella stessa fascia di distanza dal nucleo, questi orbitali potranno esprimere senza limitazioni la loro repulsione reciproca, ottimizzando la loro disposizione nello spazio tridimensionale.   Se provate anche voi a collegare 4 bacchette identiche, libere di ruotare in ogni senso, ad una medesima pallina, vi accorgerete che c’è una ed una sola disposizione che consente di avere gli angoli fra due bacchette e la pallina al tempo stesso tutti uguali e maggiori possibile: quella a tetraedro.
Il tetraedro è una figura geometrica di importanza assolutamente cruciale, che ricorre in natura ben più frequentemente di altre – giusto per fare un esempio il cubo – che pure per un motivo o per l’altro restano più facilmente incollate alla nostra memoria: basti dire che nessun bambino si ricorderà di aver giocato da piccolo con oggetti in plastica a forma di tetraedro e spesso prima dei 13-14 anni questa parola rischiamo di non averla neppure sentita nominare.   Il tetraedro è in pratica una piramide a base triangolare dove ogni lato è costituito da un triangolo equilatero: in pratica quattro triangoli equilateri identici attaccati insieme per i lati.   Quattro facce uguali, sei spigoli uguali e quattro vertici ed angoli uguali.   In un’ibridazione sp³ l’angolo formato da due orbitali ibridi rispetto all’atomo centrale è di 109,28°.

L’atomo di carbonio che è andato incontro ad un’ibridizzazione sp³ viene così a trovarsi nel centro del volume di un tetraedro ideale, con i quattro orbitali ibridi diretti internamente verso i 4 vertici. Questo piccolo elemento strutturale tetraedrico dell’ibridazione sp3 del carbonio costituisce un tassello fondamentale dal quale parte l’edificazione di strutture organiche altamente complesse: lo ritroviamo nel metano, CH₄, a legare quattro atomi di idrogeno, così come nel diamante a legare covalentemente altri quattro atomi di carbonio, che a loro volta ne legano altri quattro, e così via a loro volta, teoricamente all’infinito (salvo che il diamante ad un certo punto finisce).  Anche il silicio, posto proprio un posto sotto, nello stesso gruppo del carbonio sulla tavola periodica ma nel periodo successivo, ovvero con il livello quantico 3 invece che con il 2 in corso di riempimento, gode normalmente di un’ibridazione di tipo sp³ in tutti i silicati, dove esso si pone al centro di tetraedri circondato da 4 atomi di ossigeno.

esempi di stereisomeria

Il fatto che i 4 orbitali sp³, e di conseguenza i quattro legami che l’atomo di carbonio (e non soltanto) tetraedrico riesce a stabilire non possano “scivolare” l’uno sull’altro – cosa che comporterebbe, seppur temporaneamente, una sovrapposizione degli orbitali – ma restino al contrario confinati ciascuno nella propria zona con una certa rigidità, fa sì che quando questo atomo lega 4 atomi o gruppi differenti, siano possibili disposizioni fisse e fra loro diverse intorno ad esso, configurazioni non sovrapponibili tra loro ma che, al contrario, risultano essere l’immagine speculare l’una dell’altra.   Anche in seguito a trasformazioni di tipo reattivo, sempre che la struttura tetraedrica non venga meno in nessun momento, gli atomi ed i sostituenti ai quattro vertici dell’atomo ibridato sp³ (in questo caso noto come centro stereogenico) possono cambiare, ma la configurazione intorno ad esso resterà la stessa.

Non necessariamente tutti gli orbitali elettronici originali di un atomo che “potrebbero” combinarsi per formare orbitali ibridi di fatto lo fanno.
Nel caso dell’atomo di carbonio, giusto per rimanere in tema, uno o anche due dei tre orbitali 2p possono restare fuori dall’ibridizzazione e comparire quindi in forma p originale nelle molecole formate da questo atomo di carbonio.

piano definito dagli orbitali ibridati sp2 nell’etilene

In particolare, dalla combinazione dell’orbitale 2s con 2 dei 3 2p si ottengono e orbitali sp², obbligatoriamente schiacciati nello stesso piano a causa della perpendicolarità ad esso del restante orbitale atomico 2p che non si è combinato.  E come per il tetraedro, qui il sistema migliore per uniformare e massimizzare gli angoli tra tre orbitali su di un piano è certamente quello di disporli a 120° l’uno rispetto all’altro.
L’orbitale p rimanente potrà contribuire alla formazione di un secondo legame, rendendo così “doppio” il legame semplice già stabilito dall’atomo di carbonio con uno dei suoi orbitali sp²: come conseguenza di questo, la morfologia dell’ibridizzazione sp² e delle porzioni di molecole dove figurano atomi ibridati sp² sarà di tipo piano.

Allo stesso modo, il triplo legame carbonio-carbonio corrisponde ad un’ibridazione sp (geometria lineare), che coinvolge un orbitale s ed un solo orbitale p per ciascuno dei due atomi di carbonio: i due orbitali atomici di tipo p, fra loro ortogonali, potranno quindi sovrapporsi lateralmente, andando a costituire il secondo ed il terzo legame, entrambe di tipo pi-greco.

orbitali sigma e pi-greco dell’acetilene

I DOPPIETTI ELETTRONICI

Non è raro trovare molecole neutre nelle quali due atomi legati ad uno centrale formino tra loro un angolo pressappoco di 120°, cosa che farebbe pensare ad un’ibridazione sp² dell’atomo in questione… salvo il fatto che questo lega soltanto 2, e non 3 altri atomi come invece prevederebbe un’ibridazione di questo tipo.
Oppure un angolo di circa 109° tra due o tre direzioni di legame, come nell’ibridazione sp³… salvo il fatto che di atomi legati all’atomo centrale non ce ne sono 4, ma solo 3, o addirittura 2 soltanto.
Di fatto, uno o più di uno degli orbitali ibridi possono comportarsi come orbitali di non-legame, essendo occupati non da un elettrone passibile di condivisione, bensì di una coppia di elettroni, ovvero da quello che si è soliti definire un “doppietto elettronico”, in inglese ione pair.  Seppur non contribuiscano ai legami chimici di tipo covalente più forte (come si vedrà di seguito i legami di tipo sigma), questi legami possono dare origine ad interazioni secondarie fra le molecole ma, cosa che in questo momento ci interessa sicuramente di più, condizionano in modo determinante la geometria della molecola, quasi come se si trattasse di orbitali di legame.

angolo di legame e struttura tetraedrica della molecola dell’acqua

Un caso sotto gli occhi di tutti è quello della molecola dell’acqua nella quale, a differenza di quanto si potrebbe intuire, non vede i due atomi di idrogeno disposti lateralmente e sulla stessa linea rispetto all’atomo di ossigeno che li lega, ma angolarmente fra loro, formando un angolo H-O-H di 104,45°: la somiglianza con i 109,28° dell’angolo fra gli orbitali di un atomo ibridato sp³ non è casuale, perché è proprio da questa ibridizzazione che l’atomo di ossigeno parte nella molecola di acqua, subendo di seguito un ulteriore “schiacciamento” nell’angolo fra i due legami O-H a causa del fatto che i due orbitali ibridi che ospitano i due doppietti elettronici esercitano una repulsione elettrostatica maggiore rispetto a quella esercitata da due orbitali ibridi impegnati da legami chimici (nel legame con l’idrogeno, per esempio, almeno in parte gli elettroni condivisi gravano nell’ambito di competenza di quest’ultimo).
Un caso analogo è quello dell’ammoniaca, NH3, dove l’atomo di azoto risulterebbe “inspiegabilmente” posto al vertice di una piramide a base triangolare al posto che in centro ad un ipotetico triangolo equilatero circondato dai tre atomi di idrogeno come ci si potrebbe aspettare. Solo analizzando meglio la situazione si scopre che di fatto che l’azoto è all’incirca al centro di un tetraedro e che la posizione di vertice in apparenza libera è invece occupata da un doppietto elettronico, lo stesso che consente all’ammoniaca di esercitare il suo comportamento come base di Lewis.

Molecole come queste, composte da atomi di elementi a diversa elettronegatività, disposti in modo asimmetrico (a causa della presenza di orbitali ospitanti doppietti elettronici) intorno ad un atomo centrale si comportano come dipoli elettrici.   Una piccola peculiarità dalla quale dipendono un bel po’ di cose nell’universo, ad esempio il modo in cui la vita si è sviluppata e si mantiene ancora attualmente sulla Terra.

LEGAMI SIGMA E LEGAMI PI-GRECO

Nel linguaggio chimico si chiamano con la lettera greca σ (sigma) tutti i legami chimici dati dalla sovrapposizione “frontale” degli orbitali elettronici.
Nel caso degli atomi nei quali tutti o parte degli orbitali dello di valenza (quelli più esterni) risultano ibridizzati, i legami sigma sono dati dalla sovrapposizione frontale nel rapporto 1:1 di ciascun orbitale ibrido con un orbitale (ibrido o non) dell’atomo ad esso legato.  I legami sigma si svolgono per tanto nella medesima direzione di estensione del legame ibrido e, seppur caratterizzati da notevole forza (dovuta ad un grande volume di sovrapposizione fra gli orbitali dei due atomi) essi lasciano i due atomi liberi di ruotare intorno al legame stesso. Questa possibilità di rotazione non viene solitamente percepita quando si trattano singoli atomi legati ma può portare a conseguenze anche molto importanti qualora l’atomo legato sia connesso ad una struttura molecolare più grande, con la conseguenza della possibilità di vari stati conformazionali corrispondenti ad angoli di rotazione differenti di una parte rispetto all’altra della molecola intorno ad un legame sigma.

Al contrario si chiamano π (pi-greco) i legami “ulteriori” che si possono eventualmente formare fra atomi già legati con legami sigma, per via della sovrapposizione degli eventuali orbitali p che sono rimasti esclusi dall’ibridazione. A differenza dei legami sigma, la sovrapposizione degli orbitali nei legami pi-greco è di tipo laterale. La duplice conseguenza di questo è da un lato quello di una forza inferiore rispetto al legame sigma (dovuta ad un volume inferiore di sovrapposizione fra gli orbitali dei due atomi), dall’altra una notevole rigidità del legame, che si oppone alla libera rotazione dei due atomi legati – e di conseguenza anche di eventuali porzioni di molecola – intorno al legame pi-greco.

legami sigma e pigreco nella molecola di etilene

Anche se il legame pi-greco è di per sé stesso più debole del sigma, dal momento che esso non si presenta da solo ma “si aggiunge” a due atomi già legati fra loro con legame sigma, il doppio legame complessivo risulta anche se non il doppio, comunque più forte rispetto al legame sigma da solo.  Nel triplo legame, al quale prendono parte un sigma e due pi greco fra due coppie di orbitali p fra loro ortogonali, risulta essere un legame ulteriormente forte… ed anche un legame ulteriormente corto.

QUANDO ENTRANO IN GIOCO GLI ORBITALI D: LA GEOMETRIA DEI COMPLESSI DI COORDINAZIONE

Non solo organica, non solo carbonio e non solo covalenti i legami che possono prendere forma – o meglio, per giocare un po’ con le parole, “orientamento” – dall’ibridazione degli orbitali elettronici.

Gli elementi di transizione infatti alle già descritte possibilità di ibridazione fra orbitali s e p, possono entrare in gioco con i loro caratteristici orbitali d, rendendo così possibili un gran numero di differenti opzioni come ad esempio: sd, sd2, sd3, sd4, sd5, sp3d, sp3d2.
Anche semplicemente dall’espressione del tipo di ibridizzazione riusciamo già a leggere fra le righe il numero di orbitali fra loro isomorfi ed isoenergetici che si formeranno (ad es. 5 per l’sd4, 6 per l’sp3d2, ecc) e quindi, per le note ragioni di organizzazione spaziale, anche la disposizione dei legami – o meglio dei loro angoli reciproci – intorno all’atomo ibridato, e quindi anche la geometria dei sostituenti.
Proseguendo l’esame delle figure geometriche già affrontato per le ibridazione sp, sp2 ed sp3, quelle che comportano 5 legami sigma, come ad esempio la sd4 e la sp3d definiscono con la direzione dei propri orbitali ibridi i vertici di una bipiramide trigonale e quelle che comportano 6 legami sigma, come ad esempio sd5 e sp3d2 formano invece un ottaedro, ovvero una bipiramide tetragonale.

Queste geometrie si riscontrano con grande frequenza nei complessi di coordinazione che caratterizzano appunto gli elementi di transizione del blocco d della tavola periodica, dove un atomo del metallo di transizione i cui orbitali elettronici esterni risultano variamente ibridati fra loro, lega con legami sigma molecole neutre in grado di fornire doppietti elettronici come base di Lewis (es. acqua, ammoniaca, ossido di carbonio, ecc) o anioni (idrossido, alogenuri, nitrito, ecc) formando così strutture complesse a carattere neutro o ionico, spesso anche solubili in acqua, ancora più spesso intensamente colorate.
Ne sono degli esempi il [Cu(NH₃)₄(H₂O)₂]₂⁺ dal colore blu quasi violaceo molto intenso, stabile ovviamente solo in soluzione e solo in ambiente basico, che si può ottenere per graduale basificazione di una soluzione acquosa di un sale di rame(II) con soluzione acquosa di ammoniaca, ma in generale un po’ tutte le forme assunte dai sali più o meno idratati dei metalli di transizione, presenti in soluzione acquosa neutra per lo più come acquacomplessi.

cobalto cloruro esaidrato (a sinistra) ed anidro (a destra)

La variazione da uno stato di idratazione ad un altro dell’atomo di cobalto, con geometria differente nella disposizione delle molecole di acqua ad esso legato, sta alla base della variazione di colore del cloruro di cobalto cristallizzato, dalla forma anidra (blu) a quella diidrata (viola) a quella esaidrata (rosa): questa variazione di colore è utilizzata tanto negli indicatori colorimetrici di umidità (ad es. in abbinamento con il gel di silice negli essiccatori) che su quelle statuine in vero un po’ kitsch che cambiano colore con il variare delle condizioni di umidità dell’aria.

Analogamente al ruolo stereogenico del carbonio ibridato sp3 nelle molecole chirali, anche l’elemento di transizione impegnato in complessi di coordinazione con l’impiego degli orbitali d ibridati, a parità qualità e quantità di atomi legati può dare origine a configurazioni diverse, distinte sulla base delle posizioni reciproche di questi atomi l’uno rispetto all’altro e rispetto all’atomo centrale.

configurazioni di complessi del cobalto

Il complesso di formula [CoCl₂(NH₃)₄]⁺, per esempio, caratterizzato da 2+4=6 orbitali ibridi identici fra loro e quindi presumibilmente da una forma ottaedrica, può portare i due sostituenti Cl vicini fra loro, ovvero con un angolo Cl-Co-Cl di 90° (configurazione detta “cis”), oppure in direzione opposta, sulla stessa linea rispetto all’atomo centrale, ovvero ai due vertici dell’ottaedro (configurazione “trans”). La stessa differenziazione vale nel caso del complesso neutro [CoCl₃(NH₃)₃] dove i tre atomi uguali possono essere disposti sullo stesso piano in comune con l’atomo centrale di cobalto oppure no.
Sempre a condizione che i complessi siano sufficientemente forti nei loro legami di coordinazione, ovvero che i sostituenti non siano liberi di staccarsi e ricongiungersi all’atomo centrale come accede per i legami a carattere strettamente ionico, le diverse conformazioni assegnabili a parità di formula bruta ad un composto di coordinazione corrispondono di fatto a specie chimiche differenti, singolarmente sintetizzabili ed isolabili, dotate di caratteristiche chimico-fisiche talora diverse.  D’altronde si tratta anche in questo caso di coppie, o addirittura di serie, di stereoisomeri.

TEORIE E PUNTI DI VISTA

Questo titoletto suonerà certamente come una sgradevole provocazione per chi coltiva il mito della scienza come arbitro ultimo ed univoco della coerenza della natura.

In realtà la Natura è chiara e coerente nel suo comportamento: è la sua interpretazione, ovvero la ricerca delle relazioni causali nel suo comportamento – un’esigenza ben inteso tutta umana – ad esserlo assi meno. E’ così che nel corso della storia della scienza vengono formulate ipotesi, spiegazioni e talvolta vere e proprie teorie per spiegare alcuni aspetti della Natura che, seppur non si dimostrino “false” a distanza di anni, possono tuttavia essere sostituite da altre teorie ancora più soddisfacenti, o evolvere o sfociare in quadri di conoscenza più ampi.
Nell’ambito della struttura della materia – e quello che stiamo trattando ora ne è un caso – per descrivere in fondo lo stesso argomento sono state formulate teorie diverse, a distanza di anni o talvolta quasi in contemporanea, ognuna delle quali ha dei pregi e dei difetti.  Nel migliore dei casi una riesce a spiegare bene alcuni aspetti dell’argomento, ad esempio alcuni comportamenti della materia, dove l’altra teoria sembra annaspare di più; in altri casi semplicemente una teoria vanta basi matematiche più rigorose e dimostrabili passo per passo ma risulta di più ostica applicazione (ad esempio richiederebbe apparati di calcolo al momento imensabili) mentre l’altra, seppur meno rigorosa si presta ad una applicazione più intuitiva riuscendo a spiegare meglio i comportamenti osservati e/o a prevederne di nuovi.
E in fondo, non è a questo che ci serve la conoscenza, specie quando prende la forma di una teoria?

Il ricorso concettuale ai legami di tipo sigma e di tipo pi greco per giustificare caratteristiche geometriche ed energetiche dei legami chimici e, di conseguenza, delle molecole nelle quali essi figurano, non dipende conseguenzialmente dalla teoria dell’ibridazione degli orbitali atomici, essendo fra l’altro storicamente precedente ad essa.   E’ dagli anni ’20 del XX secolo, infatti, che la Teoria del Legame di Valenza (VBT) formulata da Linus Pauling, W. Hitler, F. London e J. Slater ha introdotto i concetti di legame sigma e pi greco insieme al concetto di fondo secondo il quale i legami chimici si formerebbero come conseguenza dell’appaiamento degli elettroni degli orbitali dello strato di valenza degli atomi, attraverso quella che viene solitamente interpretata come una fusione per sovrapposizione di questi orbitali atomici.

Linus Pauling (1901-1994) – Premio Nobel per la Chimica nel 1954; Premio Nobel per la Pace nel 1962

L’ibridizzazione degli orbitali elettronici di tipo atomico è stata di fatto introdotta successivamente, a partire dallo stesso Pauling come evoluzione della suddetta Teoria del Legame di Valenza, nel suo noto libro pubblicato nel 1939 ed ancora oggi largamente ristampato con l’introduzione ed i commenti da parte di illustri chimici “The Nature of the Chemical Bond”.
Il ricorso all’ibridizzazione degli orbitali atomici introdotta, seppur ancora in sordina in occasione di questa pubblicazione, si è subito affermata grazie alla sua “usabilità” ai fini della spiegazione e della previsione della geometria di ioni e molecole, nonché talvolta addirittura dello stato di valenza effettivamente dimostrato da alcuni elementi, ad iniziare dallo stesso carbonio degli esempi riportati nei capitoli precedenti (es. il metano sarebbe stato una struttura inspiegabile tenendo conto della sola teoria del legame di valenza).

E’ attualmente in corso un dibattito scientifico relativo non tanto alla fondatezza scientifica, quanto all’utilità ed al valore specie in sede didattica delle diverse teorie attualmente accettabili per spiegare ed interpretare le caratteristiche geometriche ed energetiche dei legami chimici e quindi delle molecole delle quali essi fanno parte.
A questo proposito si sta affermando sempre più la proposta, almeno a livello di percorso di studi non specialistico, di evitare il ricorso certamente più complesso dal punto di vista delle comprensione teorica ed in questa sede tutto sommato poco “utile” della Teoria degli Orbitali Molecolari (MO) ma anche di quella del Legame di Valenza con la sua evoluzione in funzione dell’ibridizzazione degli orbitali atomici, a favore invece della Teoria VSEPR (Valence Shell Electron Pair Repulsion, ovvero repulsione delle coppie elettroniche nel guscio di valenza) che, seppur di più immediata comprensione, avrebbe il difetto di mal adattarsi ad un’applicazione previsionale di tipo quantitativo.

La grossa distinzione che ci preme fare fin dall’inizio è relativa alle condizioni redox dell’ambiente nel quale l’organismo morto si viene a trovare.
Da un lato vi sono le cosiddette condizioni anaerobiche, o asfittiche, caratterizzate dal fatto che l’ossigeno non penetra con facilità, magari perché il terreno è molto compattato, o meglio ancora perché resta costantemente impregnato di acqua, e l’acqua sì può sciogliere una certa concentrazione di ossigeno, ma se essa non viene ricambiata, ed in compenso in quell’acqua ci vivono folte colonie di microrganismi aerobi, tempo pochi giorni e quell’acqua sporca sarà diventata un ambiente decisamente poco favorevole all’ossidazione.

colore bruno di acque dolci ricche in acidi umici e fulvici

I concetti di ossidazione e di riduzione, che siamo abituati ad imparare nel contesto della chimica inorganica, estendendoli successivamente ad alcune classi di sostanze organiche (es. sappiamo che ossidandosi un alcol primario si trasforma in aldeide, e da questo per ulteriore ossidazione in acido carbossilico), si possono applicare agevolmente a tutti gli atomi di carbonio, organico ed inorganico.   La regola è quella per la quale, partendo dallo zero, si considerano negative tutte le valenze espresse verso gli atomi maggiormente elettropositivi (es. idrogeno) e positive tutte quelle espresse verso atomi maggiormente elettronegativi (es. ossigeno, azoto, zolfo, alogeni), mentre i legami tra atomi di carbonio sono computati come zero.   Una “dritta” questa che farà rabbrividire certamente i puristi della definizione chimica, ai quali rivolgo la preghiera, se capaci, di fornirne una più rigorosa… purché ugualmente efficace nell’ambito di un articolo che parla in realtà di tutt’altro.
A partire dalle sostanze organiche naturali, nei quali il carbonio ha uno stato di ossidazione “formale” intermedio fra i due estremi del -4 (alcani) e del +4 (biossido di carbonio), sono possibili quindi due percorsi, uno di tipo riduttivo e l’altro di tipo ossidativo.

DALLA VITA AL CARBONIO FOSSILE

Del percorso di degradazione di tipo riduttivo della sostanza organica proveniente dalle spoglie ex-viventi negli ambienti maggiormente privi di ossigeno si è avuto modo di parlare in passato in un articolo appositamente dedicato a “La chimica della putrefazione”.   In questo testo si argomentava in particolare riguardo ai prodotti ultimi, di tipo solitamente volatile, derivanti da una degradazione completa in condizioni anaerobiche dei materiali organici di origine biologica: metano ed altri idrocarburi saturi a corta catena, ammoniaca, fosfina, acido solfidrico, eventualmente idrogeno, e naturalmente acqua.  Tutti prodotti a loro modo volatili, tossici e spesso intensamente maleodoranti, che vengono associati – anche da punto di vista psicologico – ad ambienti mortiferi.   Prodotti nei quali l’elemento che funge da anione si trova al suo stato di ossidazione più basso fra quelli possibili per lo stesso elemento.

Mentre sul ruolo rivestito dalla decomposizione anaerobica della sostanza organica di origine biologica nella formazione dei depositi di petrolio sussistono al momento ancora delle teorie contrastanti (esiste infatti una scuola di pensiero che interpreta in termini abiotici la formazione del petrolio) nessun dubbio avvolge invece la formazione dei depositi del carbone, non per niente definito carbone fossile.

Nel carbone stesso sono infatti rinvenibili e riconoscibili, seppur ampiamente trasformati nell’aspetto e nella composizione, i resti delle piante originali – specie di quelle di enormi dimensioni che popolarono la Terra nell’era di massimo sviluppo del regno vegetale, il carbonifero appunto (280-345 milioni di anni fa) – il cui carbonio è stato interamente o quasi ridotto allo stato elementare.  Il carbone non costituisce uno stato allotropico alternativo alla grafite ed al diamante, bensì uno stato disorganizzato ed impuro di carbonio poco o per nulla cristallizzato che si è originato per trasformazione riduttiva di questi vegetali, dapprima cresciuti e morti in ambienti umidi e paludosi, quindi decomposti in condizioni anaerobiche di sommersione, in seguito sottoposti a trasformazioni geologiche sotto l’effetto di calore e di pressione.
I materiali parzialmente trasformati che si possono incontrare durante il lentissimo processo di formazione del carbone (in ordine di evoluzione: torba, lignite, litantrace ed antracite) possono presentare tutte le sfumature di aspetto e di composizione chimica intermedie tra i materiali (soprattutto vegetali) originali ed il carbone nero e dall’aspetto roccioso che un po’ tutti conosciamo.

torba

La torba è da tutti conosciuta più alla stregua di una tipologia di terreno piuttosto che di un precursore del carbone, e di fatti i resti vegetali – soprattutto di piante erbacee – che essa contiene sono statica tutti gli effetti fossilizzati, almeno non in modo completo, in quanto all’inizio della storia della loro formazione (tra l’era terziaria e l’era quaternaria) sono stati in qualche modo sottratti ad un’ulteriore riduzione in seguito alla riesposizione all’aria.
Uno dei requisiti affinché le spoglie vegetali si trasformino in torba anziché seguire atri percorsi di decomposizione è il clima non eccessivamente caldo: dall’Irlanda alla Terra del Fuoco nell’estremità meridionale del continente americano, dall’Islanda all’Olanda le torbiere più vaste del mondo si sono formate nei luoghi di antiche paludi in climi freddi o al limite temperati.
Oltre a conservare gran parte dell’acqua iniziale (fino ad un massimo del 90% circa in peso), la torba mostra ancora l’aspetto fisico filamentoso dei vegetali dai quali si è formata, e dal punto di vista chimico anche un’elevata presenza dell’ossigeno originalmente presente nelle molecole biologiche.   Elevato grado di umidità e potere calorifico poco elevato (5000 kcal/kg sul prodotto essiccato) non ne giustificando l’impiego come combustibile su larga scala, mentre il suo impiego d’elezione è come ammendante agricolo per migliorare la sofficità del terreno (aerazione e penetrabilità da parte delle radici) e la sua capacità di trattenere acqua al suo interno, riducendone la perdita per percolazione negli strati profondi.

lignite

Inizia già a parlarsi di “carbone” con la lignite: un materia che, come ci suggerisce lo stesso nome, richiama anche nei suoi aspetti strutturali il legno stesso dal quale ha avuto origine, circa 80 milioni di anni fa, successivamente quindi al carbonifero, dalle foreste dell’era secondaria e terziaria.
Più scuro della torba, più chiaro del carbone propriamente detto (il litantrace) e fra questi intermedia un po’ per tutte le caratteristiche composizionali, dal contenuto in carbonio elementare (70%) a quello in acqua (dal 13% al 45%) la lignite non è un buon combustibile (potere calorifico da 4100 al 6500 kcal/kg espressi sul secco) ma viene largamente utilizzata come materia prima per la produzione di ulteriori sostanza carboniose ridotte, come ad esempio alcani volatili da utilizzare a loro volta come combustibile gassoso o per sintesi.

litantrace bituminoso

Il litantrace è il carbone fossile tout-court, quello che riunisce in sé il miglior compromesso tra un elevato contenuto in carbonio elementare (75-90%) ed un minore contenuto in acqua – e quindi un maggiore potere calorifico (7000-8500 kcal/kg), con una reperibilità sufficiente per giustificarne l’impiego su scala industriale, tanto come combustibile quanto nella produzione di ghisa insieme ai minerali del ferro.
Trattandosi di un materiale molto diffuso e studiato, se ne conoscono numerose varianti, differenziate in relazione alle caratteristiche fisico-strutturali ci compattezza e porosità, ma anche chimico-composizionali come per esempio il livello di impregnazione con sostanze bituminose (“grassezza” del litantrace) e delle sostanze volatili, principalmente idrocarburi, che possono in taluni casi superare il 25% in peso del litantrace.

antracite

L’antracite è infine il carbone con più alto contenuto in carbonio elementare (circa il 90%) ed al tempo stesso quello di origine più antica, prossima a 400 milioni di anni or sono.

In ambienti fortemente carenti di acqua, condizione “sin e qua non” per l’affermarsi della vita – anche di quella degli stessi organismo decompositori – neanche il decorso di putrefazione anaerobica e quello di riduzione del carbonio al suo stato elementare possono prendere piede in modo significativo.

gatto mummificato

In queste condizioni, infatti, le spoglie ex-viventi tendono a cedere la loro stessa acqua, fino al punto di disidratarsi ponendo quindi fine ad un’eventuale decomposizione, almeno in chiave macroscopica e creando così i presupposti per la conservazione del cadavere medesimo, o almeno dei suoi tratti morfologici macroscopici, come succede nei processi di mummificazione.   In questi casi l’eventuale rimozione di parti facilmente fermentescibili – ad alto contenuto in acqua e/o in soluti facilmente attaccabili dai microrganismi decompositori – insieme talvolta all’apporto dall’esterno di sostanze chimiche con funzione “antibiotica” possono coadiuvare in modo importante il processo di conservazione dei tessuti nella collocazione ed all’incirca anche con la composizione originale, dal punto di vista istochimico: il fattore determinante nella formazione delle mummie, siano esse animali o vegetali, naturali o volute dall’uomo, resta comunque il livello di disidratazione.

LA DEGRADAZIONE OSSIDATIVA DELLA SOSTANZA ORGANICA DI ORIGINE BIOLOGICA NEL TERRENO

Al contrario del decorso riduttivo, una degradazione ossidativa – quella che dovrebbe costituire “la norma” vista l’atmosfera ricchissima di ossigeno che contraddistingue il nostro pianeta – porta la sostanza organica di origine biologica lungo un percorso noto come mineralizzazione, caratterizzato da un graduale incremento nel numero di ossidazione delle specie chimiche coinvolte, ed in particolare del carbonio, dell’azoto, del fosforo e dello zolfo.
Fino alla restituzione delle relative specie inorganiche: anidride carbonica, ammonio (e da questo nitrati), fosfati e solfati, e naturalmente acqua, oltre a tutti i sali minerali assorbiti che tornano ad essere disponibili in forma di elettroliti.   E’ questo il percorso attraverso il quale, seppur attraverso mille vicissitudini, gli elementi tornano finalmente a rendersi nuovamente disponibili per il loro assorbimento da parte di piante, funghi e della maggior parte dei batteri.
Capita però che lungo questo percorso succeda qualcosa.  Dei rallentamenti, come minimo, dovuti per esempio proprio alla grande quantità di sostanza organica che si depone, ma anche a difficoltà oggettive in uno o in più stadi della degradazione ossidativa, in pratica di quelli che si potrebbero definire dei coni di bottiglia.  Capita in particolare che la parziale degradazione, o anche l’eventuale ricombinazione in itinere lungo il percorso della mineralizzazione porti in quelli che, sempre restando nell’ottica della decomposizione della sostanza biologica originale, potrebbero apparire come dei vicoli ciechi, dei “cul del sac”: molecole che, una volta che si arriva lì, non è più facile andare oltre.
Mancano enzimi “in giro nel terreno” in grado di scinderle ulteriormente, o microorganismi in grado di incorporarle riconoscendole come potenziali substrati trasformabili, o semplicemente sono troppo pochi, oppure per mettersi a fare un lavoro tanto difficile dovrebbero essere ridotti veramente alla fame, e nel terreno c’è sempre qualcosa di meglio di cui cibarsi…
In sostanza, come anime chimiche intrappolate lungo il percorso che porta dalla morte alla rinascita, queste sostanze si accumulano nel terreno.  E da questa posizione speciale queste sostanze, non più vive ma ancora organiche, assistono la vita, fornendo ad essa supporto.
Questi angeli del terreno sono le sostanze humiche.

Nell’immaginario comune l’humus è oggi sinonimo di fertilità del terreno.
Ma non è stato sempre così ed anzi, la scoperta dell’importanza di questa sostanza per la nutrizione e la vita delle piante è entrato ufficialmente a far parte del pensiero scientifico solo a partire dal 1844, anno della traduzione in lingua inglese del libro in quattro volumi “Principii dell’agricoltura razionale” dell’agronomo tedesco Albrecht D. Thaer (1752-1828).
Se dovessimo domandare invece ad un agricoltore, ma diciamolo pure anche ad un chimico, le ragioni per quali l’humus riveste una tale importanza nel benessere delle piante e, più in generale, nella vita che il terreno ospita, dubito che riusciremo a mettere insieme una spiegazione plausibile.
Vediamo ora di comprendere le ragioni di questa difficoltà, che affonda le radici in una complessità duplice, sia di tipo chimico-composizionale che di tipo biologico-agronomico.

Innanzitutto l’humus non è una molecola precisa, che possa essere riportata ad una struttura chimica precisa.   Se proprio vogliamo definirlo, potremo includerlo nella categoria degli eteropolimeri, categoria in realtà tanto ampia quanto indeterminata, dal momento che accoglie al suo interno un po’ tutte quelle molecole di alto o altissimo peso molecolare, la cui struttura può variare all’interno di margini anch’essi piuttosto ampi: eteropolimeri per esempio sono riconosciuti essere anche la lignina (come vedremo in seguito curiosamente imparentata con lo stesso humus) e persino le proteine nel loro insieme.

possibile struttura di un acido umico

Già da questo inizia a risultare chiaro come “la chimica dell’humus” potrebbe tranquillamente essere l’argomento di un’enciclopedia, di una rivista specializzata oppure di un master universitario, e non a caso abbiamo scelto di riportare qui di seguito in formato immagine una raccolta di copertine di libri pubblicati negli ultimi anni sull’argomento.
Il peso formula delle molecole che entrano a far parte dell’humus non è poi così elevato come si potrebbe immaginare: da poche centinaia all’ordine delle migliaia di u.m.a. Buona parte delle sue proprietà più complesse e benefiche ai fini della fertilità del terreno infatti – come ad esempio le proprietà colloidali, quelle chelanti, assorbenti e di scambio ionico – più che ad un peso molecolare da macromolecola, sono dovute alle interazioni supramolecolari tra molecole diverse dell’humus, ed alla presenza sulla stessa molecola di elementi strutturali e gruppi funzionali molto diversi fra loro.  Osservando per esempio la struttura molecolare proposta per singole unità di humus si possono chiaramente individuare “pezzi di molecole” che ci ricordano chiaramente le relative classi di sostanze organiche naturali che un tempo facevano parte dei viventi: carboidrati, lipidi, aminoacidi, polifenoli, acidi nucleici e così via… in parte trasformati, sicuramente, ma soprattutto legati fra di loro con la formazione di nuove specie chimiche, delle sorte di chimere aliene alla composizione originale delle piante o degli animali dai quali esse hanno avuto origine.
D’altra parte, lo ricordiamo qui per l’ultima volta, l’humificazione può essere considerata a tutti gli effetti come una sorta di deviazione laterale di parte (una piccola parte) della sostanza organica dal ciclo propriamente detto del carbonio: parte della sostanza organica ex-vivente, dopo aver subito un primo step di parziale mineralizzazione, con la conseguente liberazione di piccole molecole organiche solubili e di ioni minerali inorganici, subisce una riorganizzazione in qualcosa di diverso e tutt’altro che elementare.  Artefici di questa trasformazione, agita per lo più sotto catalisi enzimatica, sono alcune classi dei cosiddetti organismi decompositori, quali funghi, batteri ed attinomiceti, tutti organismi attivi in particolare negli strati superiori e più aerati del terreno, in condizioni di pH neutro o debolmente basico.

organismi decompositori del terreno

L’humus propriamente detto non rappresenta quindi l’unico punto di arrivo dei processi di degradazione ossidativa delle sostanze organiche nel terreno: il primo step di questa trasformazione infatti è in grado di “decomporre” (in questo caso in modo propriamente detto) i tessuti viventi nei loro singoli componenti, appartenenti alle rispettivi classi chimiche (es. carboidrati, proteine, lipidi, acidi nucleici, ecc). Queste molecole vengono così restituite al terreno andando a costituire quella che gli agronomi definiscono “sostanza organica non umica” e divenendo disponibili per l’assorbimento e la metabolizzazione anche da parte dei microrganismi “meno fantasiosi”, quelli per intenderci più opportunisti e qualunquisti, che catabolizzano le molecole organiche più semplici portando il carbonio fino alla sua forma completamente ossidata, corrispondente all’anidride carbonica, che viene quindi liberata come sottoprodotto finale.
Pur non contribuendo alla sostanza organica, buona parte dei sali minerali, sicuramente i cationi e gli ioni fosfato (che continua a mantenere la sua struttura di anione inorganico anche quando esterifica funzioni alcoliche nei carboidrati nei contesti biochimici) vengono restituiti al terreno durante questa prima fase del processo di mineralizzazione.

PROPRIETA’ DELL’HUMUS NEL TERRENO

Nonostante gli ampi margini di variabilità strutturale dei quali può godere, l’humus del terreno presenta delle qualità chimico-fisiche ricorrenti che, in ultima analisi, si possono riportare a delle sue ricorrenze strutturali tipiche.

Credo che chiunque non avrà alcun dubbio nel riconoscere la grandiosità di questo eteropolimero naturale – e quindi a volerne conoscere più da vicino la natura chimica – dopo aver letto il seguente elenco relativo alle proprietà ed alle capacità di interesse agronomico espresse dalle sostanze umiche:

-  Proprietà colloidali (rispetto ad un solvente acquoso);
–  Assorbimento e trattenimento dell’acqua;
-  Scambio ionico (in particolare cationico);
–  Chelazione di metalli (soprattutto bi- e trivalenti come Ca²⁺, Mg²⁺, Fe²⁺, Fe³⁺, Mn²⁺, ecc);
–  Tamponamento del pH;
–  Proprietà redox.

colloidi umici come “luogo” delle reazioni chimiche nel terreno – “BC”: colloidi humici; “b”: batteri di varie specie; “OM”: materia organica; “c”: cationi

Diverse di queste proprietà possono essere viste, in un contesto ecologico, come una sorta di volano in grado da un lato di tamponare situazioni puntuali ed istantanee relative a concentrazioni anomalmente elevate di sostanze in forma solubile (es. cationi metallici, acidi e basi libere, ossidanti, la stessa acqua di irrigazione o meteorica), dall’altra di restituire queste stesse sostanze in modo graduale ed equilibrato quando l’ambiente circostante dovesse impoverirsene.  E’ in questo contesto che è valida l’affermazione comune secondo la quale l’humus costituisce una riserva di nutrienti per le piante, ed anche per gli altri organismi del suolo: in realtà non sono le sostanze humiche stesse a costituire il nutrimento per la maggior parte degli organismi, bensì ciò che esse sono in grado di trattenere nei momenti di abbondanza (o addirittura di pericoloso eccesso) e di rilasciare nei momenti di carenza.
Dietro a questo comportamento, ovviamente, non ci cela nessun intento etico da parte della sostanza: si tratta semplicemente del rispetto dei principi chimico-fisici degli equilibri chimici, quelli per i quali Le Chatellier già nel 1884 affermava nel suo celebre principio “ogni sistema tende a reagire ad una modifica impostagli dall’esterno minimizzandone gli effetti.”

ruolo attivo dell’apparato radicale delle piante nello scambio cationico con i colloidi umo-argillosi del terreno

Oltre al suddetto meccanismo di restituzione passiva, il rilascio dei cationi minerali utili alla crescita della pianta può essere indotta dallo stesso apparato radicale attraverso la sua cessione nel terreno di idrogenioni che, sulla spinta di un sufficiente fattore di concentrazione, possono sostituire ad esempio potassio, calcio e magnesio dalla superficie a carattere anionico dei colloidi umo-argillosi.   Gli ioni idrogeno possono a loro volta essere rilasciati nel terreno direttamente dall’apparato radicale delle piante, oppure formarsi in seguito alla dissociazione dell’acido carbonico, formato a sua volta per reazione con l’acqua del terreno dell’anidride carbonica anch’essa rilasciata dall’apparato radicale per via della respirazione cellulare.

I gruppi funzionali responsabili del tamponamento del pH sono rappresentati in primo luogo dai gruppi carbossilici e secondariamente dai fenolici, entrambe attivi in un range di pH dal basico al neutro, mentre verso le variazioni in campo acido il fattore tampone è sorretto principalmente dalle funzionalità azotate, soprattutto dai gruppi aminici, come si vedrà meno rappresentati all’interno delle sostanze humiche, da cui il carattere di acido debole comunemente assegnato ai singoli componenti dell’humus.

Legenda:
S: particella non colloidale
A: colloide minerale
H: colloide organico
I: acqua d’imbibizione
C: acqua capillare
m: macroporo

Oltre a rappresentare una sorta di ponte ideale fra il vivente ed il non vivente, l’humus costituisce anche – ed in questo caso non si tratta di retorica – un ponte fra la frazione organica e quella inorganica, o meglio ancora minerale, del terreno.   Il comportamento segue percorsi differenti a seconda di quella che gli agronomi chiamano “la reazione” del terreno, ed i chimici definirebbero semplicemente come il pH.  In terreni acidi l’humus forma complessi con i cationi alluminio e ferro facenti parte di colloidi idrofobi ed elettropositivi, riducendone il dilavamento da parte dell’acqua.   Ma è nei terreni a pH neutro o debolmente basico che le sostanze humiche danno il meglio di loro, legandosi alla frazione argillosa (già aggregata in particelle di frazione di millimetro di diametro) tramite ponti calcio, con la formazione di complessi di tipo umo-argilloso: le particelle secondarie così formate, grandi da uno a più millimetri, vanno a costituire quella struttura “glomerulare” tanto desiderata a livello agronomico.   Si può osservare nell’immagine esemplificativa qui a lato come la varietà strutturale del terreno (nel senso sia della sua tessitura granulometrica che della composizione degli stessi granuli) sia una condizione decisamente favorevole ai fini di una equilibrata presenza di aria ed acqua nel terreno: la zona dei macropori (m) è occupata prevalentemente dall’aria, mentre l’acqua non vi è trattenuta e per tanto percola rapidamente; al contrario l’acqua trattenuta capillarmente “tra” le particelle – qualunque esse siano – è trattenuta ma risulta pur sempre disponibile per le piante che, seppur spendendo energia per attingerla, possono avvantaggiarsene.  Al contrario, l’acqua di imbibizione, quella che riveste la superficie di ciascuna particella e che è particolarmente abbondante nei colloidi humici (l’humus riesce ad assorbire fino a 20 volte il suo peso in acqua), contribuisce fortemente alla struttura ed alle proprietà fisico-meccaniche del terreno ma risulta così fortemente legata alle particelle colloidali idrofile (tensione matriciale) da divenire difficilmente utilizzabile da parte delle piante.

Per quanto riguarda il colore, anche se siamo soliti associare l’abbondanza dell’humus alle note scure, sono note tutte le varianti che partono dal giallo ed arrivano fino al nero, passando per tutte le tonalità del bruno.

STRUTTURA ED ORIGINE DELL’HUMUS

A un occhio già un po’ allenato a guardare alle sostanze organiche naturali sulla base della loro struttura, dando uno sguardo alla molecola qui a fianco – ripetiamo riportata a titolo puramente esemplificativo – non sarà di certo sfuggita una certa somiglianza con un’altra sostanza di origine naturale, anch’essa un eteropoliero, anch’essa che non brilla certo per biodegradabilità, ma al contrario dell’humus caratteristica dei sistemi biologici “in vivo”, ed in particolare delle piante. Stiamo parlando della lignina, quell’intricato polimero tridimensionale costituito da unità aromatiche di tipo benzeniche variamente ossidrilate con funzioni fenoliche – in vero in gran parte ossidate a chinoni – e con funzioni metossiliche, tenute insieme da catene propeniche, anch’esse ossigenate con gruppi alcolici, il tutto strettamente interlacciato – almeno questa è la realtà che più frequentemente ricorre nelle piante – con un’altra tipologia di polimeri, le emicellulose, mediante legami etere o estere. Una nota proiezione esemplificativa della struttura molecolare della lignina e le sue caratteristiche è disponibile nell’articolo “Da cosa è fatto il legno?”.

composione del legno

Pur non potendo affermare che l’humus si origina per sola degradazione della lignina, non possiamo tuttavia negare che questa sostanza ne costituisce un fondamento strutturale probabilmente irrinunciabile. Basti vedere la ricorrenza degli anelli aromatici e delle funzioni fenoliche e chinoniche riscontrabili anche a fronte di analisi spettroscopiche anche su sostanze umiche insolubili (es. tramite spettroscopia nel medio infrarosso) per intuire che le altre sostanze aromatiche presenti nei tessuti ex-viventi, tutte insieme, non basterebbero comunque a giustificare questa abbondanza di anelli benzenici.  A ricordarci la lignina, o meglio ancora come questa risultava strutturalmente legata a molecole di natura glicidica (come i pentosani delle emicellulose) troviamo anche nelle sostanze umiche la presenza sporadica di residui di carboidrati, non del tutto consumati dall’attività microbica di trasformazione.
Rispetto alla lignina però ricorrono importanti variazioni: in primo luogo la presenza, talvolta abbondante, di funzioni azotate – sia di tipo aminico alifatico che inserite in eterocicli – e la ricorrenza di gruppi funzionali carbossilici.
In generale si osserva un rapporto ossigeno/carbonio sensibilmente più elevato rispetto alle formule minime riferibili alla lignina: risultato questo quanto mai evidente che si tratta di molecole che hanno subito una prima trasformazione di tipo ossidativo in un ambiente ricco di ossigeno e con “la giusta” quantità di acqua.

FRAZIONI DELLE SOSTANZE HUMICHE

Quello che abbiamo fino a questo momento chiamato con la denominazione generica di humus – o di sostanze humiche – viene solitamente classificato in seguito a test di laboratorio sulla base delle due proprietà di solubilità in 3 frazioni principali:

-  Acidi humici
-  Acidi fulvici
-  Humina

Gli acidi sia humici che fulvici si sciolgono (o meglio ancora: “vengono estratti come un sol colloidale) in una soluzione diluita di alcali forti (es. idrossido di sodio): portando il pH in campo nettamente acido, ovvero fino a pH 1 tramite la graduale aggiunta di acido cloridrico, tuttavia, gli acidi humici tornano ad insolubilizzarsi e quindi precipitano, mentre gli acidi fulvici restano comunque in soluzione.
L’humina è invece quello che resta dal trattamento di estrazione, in quanto risulta insolubile anche in soluzione acquosa diluita di alcali.
Gli acidi fulvici, in linea con le loro caratteristiche di solubilità, presentano un ridotto peso molecolare ed un’incidenza particolarmente elevata, rispetto alle dimensioni della molecola, di gruppi idrofili (in particolare alcolici, fenolici e carbossilici), suscettibile fra l’altro di un’agevole salificazione già a partire da pH prossimi alla neutralità.  Anche l’abbondanza relativa della componente aromatica rispetto a quella alifatica negli acidi fulvici è caratteristicamente sbilanciata a favore di quest’ultima.

esempi di strutture molecolari di acidi fulvici

Tra le diverse strutture molecolari proposte e le poche effettivamente individuate fra gli acidi fulvici compaiono ben raramente anelli benzenici fra loro condensati: questo, insieme al basso tasso di insaturazioni coniugate, comprese quelle chinoniche, spiegherebbe la colorazione relativamente chiara di questa frazione dell’humus, una delle più influenti nel determinare la colorazione bruno-giallastra (pur nella sua trasparenza) di alcuni corsi d’acqua, come quello qui riportato in fotografia.

esempio struttura di acido humico

Agli acidi humici propriamente detti corrispondono strutture molecolari di dimensioni maggiori, una ricorrenza più elevata di anelli aromatici, anche condensati fra loro, elementi e gruppi funzionali diversi (comprensivi di aminici, tiolici, nitrili ed eterociclici vari) oltre che di porzioni molecolari idrofobiche come per esempio catene alifatiche che ricordano da vicino quelle degli acidi grassi ed anelli aromatici non ossidati… strutture queste che fanno in qualche modo presagire un legame fra la materia organica ex-vivente ed il petrolio, se si ammette in effetti la sua origine fossile.  Queste porzioni molecolari, talvolta significativamente estese, possono essere anche viste in funzione di un’anisotropia nella densità di carica che, addensata sui gruppi polari, diventa rarefatta in corrispondenza di queste zone: è qui che hanno luogo le interazioni deboli di tipo supramolecolare (es. interazioni pi-greco-pi-greco fra anelli benzenici, forze di Van der Waals, ecc) che consentono l’assorbimento di altre piccole molecole apolari e gli stessi legami fra unità divere di acidi umici a formare aggregati di dimensioni più grandi.
Al di là della struttura molecolare dei singoli componenti degli acidi umici, durante la loro titolazione acido base (ad esempio sull’estratto acquoso in alcali) è possibile notare due differenti pKa: la prima intorno al valore di 8 è relativa alla protonazione dei gruppi fenolati, la seconda, che si colloca in condizioni più acide, intorno a pKa 4 relativa alla protonazione dei gruppi carbossilici.
L’abbondanza dei gruppi fenolici e dei gruppi carbossilici, ed in particolare l’articolazione spaziale di questi ultimi, costituisce il fattore strutturale che consente agli acidi umici, sicuramente meglio rispetto ai fulvici, di creare complessi (chelati) con i cationi metallici nel terreno.

L’umina in qualche modo è quello che resta dell’humus dopo l’estrazione, ovvero la frazione che non passa in soluzione acquosa di alcali forti.
Si tratta non a caso della frazione meno studiata dell’humus: gran parte delle tecniche analitiche attualmente disponibili, specie quelle che procedono in direzione di un frazionamento della miscela nelle singole specie chimiche costituienti, richiedono infatti come requisito la solubilità della sostanza in una qualche miscela.
Già sulla base delle sue proprietà chimico-fisiche, dell’umina possiamo però già immaginare che si tratti di miscele assai complesse di sostanze ad alto peso molecolare, povere di funzionalità carbossiliche e fenoliche e forse anche ricche di porzioni molecolari idrofobiche.

Tanto gli acidi humuci quanto quelli fulvici e l’umina sono da tempo disponibili sul mercato anche in frazioni separate, per impieghi sia in campo agricolo come ammendanti e addirittura per applicazioni insospettabili quali integratori alimentari.

CONCLUSIONI

“La terra non è una cosa che ti cresce sotto i piedi” – potrebbe affermare un saggio extraterrestre, ben consapevole della rarità e del valore di questa inestimabile risorsa – “Per poter apprezzare la terra, vi consiglio un giro sul pianeta che da essa ha preso appunto il nome: la Terra!”.
Una battuta che è destinata tuttavia a richiamare la nostra attenzione su un fatto tutt’altro che trascurabile: il terreno, così come noi lo immaginiamo e come lo stiamo descrivendo in questo articolo, non si sviluppa su tutti i pianeti, anzi, potremo a ragione definirlo come una sorta di rarità in ambito astronomico.  Non fosse altro per il fatto che il processo di pedogenesi così come noi lo intendiamo necessita della presenza di vita. Questa vita, che cresce in parte “sul” ed in parte “nel” terreno, fino a divenirne parte integrante, in aggiunta ai fattori abiotici di trasformazione (es. meccanici, chimici, idrogeologici, ecc) fa sì che la terra stessa possa essere in qualche modo intesa come una sorta di organismo vivente e la stessa ecologia possa essere intesa per similitudine come lo studio della sua biologia.

[su questo argomento si rimanda ad un articolo già pubblicato:  "Dai cicli degli elementi all'ecochimica: quando è il pianeta stesso a vivere"]

Ma torniamo alla nostra visione d’insieme su questo mondo incredibilmente complesso ed affascinante che stiamo stringendo nella mano.
Dal punto di vista scientifico, il terreno può essere definito come un miscuglio eterogeneo con composizione indefinita anche sul piano qualitativo.
Per cominciare, in esso coesistono tutti e tre i principali stati di aggregazione della materia: solido, liquido (l’acqua e le sue soluzioni) e gassoso (principalmente, ma non unicamente, l’aria atmosferica).

LA STRUTTURA DEL TERRENO

A volte anche il chimico deve chiudere un occhio e, prima di domandarsi “da cosa è fatta” una cosa, deve accontentarsi di osservare “com’è fatta”.
La prima cosa che salta all’occhio quando si parla di un terreno è la sua tessitura, o granulometria, o meglio ancora “distribuzione granulometrica”: ammettendo che un terreno, magari un incolto, possa contenere al suo interno dalle pietre così pesanti da non riuscire a sollevarle alle microparticelle di diametro inferiore ai 2 micron, risulta di fondamentale importanza per qualsiasi pratica agronomica ma anche per la preservazione idrogeologica del territorio conoscere quali sono i rapporti tra le diverse frazioni granulometriche che caratterizzano il terreno in esame.  Esigenza questa ancora più importante se si considera il fatto che ciascuna frazione determina non soltanto un effetto fisico-meccanico, ma anche un’influenza chimico-biologica differente.

coni utilizzati per la stratificazione in dispersione acquosa delle frazioni granulometriche fini del terreno

Esistono delle leggere differenze nella definizione dei limiti delle classi di diametri delle particelle che compongolo la cossiddetta “terra fine” in un suolo: secondo la distinzione del Dipartimento dell’Agricoltura degli Stati Unitic (USDA), maggiormente utilizzata al mondo, e secondo l’organismo internazionale ISSS.  Secondo l’USDA le classi diametriche della terra fine sono:
•  argilla, con diametro minore di 2 micron;
•  limo, diametro compreso fra 2 e 50 micron;
•  sabbia, fra 50 micron e 2 mm.
La determinazione della granulometria viene effettuata solo sulla parte di terra fine, viene quindi eliminata la parte di scheletro tramite setacciatura. Per una determinazione ottimale vanno effettuati dei pretrattamenti:
•  aggiunta di HCl fino a pH 3, in modo da eliminare i carbonati;
•  trattamento con H2O2 per ossidare la sostanza organica;
•  aggiunta di una soluzione di metafosfato sodico o “calgon” per agevolare la dispersione e impedire la riaggregazione delle particelle.
Diverse sono le modalità per approcciare lo studio granulometrico della frazione fine del terreno: il più utilizzato è quello “ad umido”, che si basa sulla diversa velocità di sedimentazione delle particelle, in base alle loro diverse dimensioni, all’interno di un cono trasparente e graduato.

Una volta determinata l’incidenza percentuale delle tre frazioni principali (sabbia, limo ed argilla), si può procedere alla determinazione della tessiture del terreno per mezzo di un diagramma triangolare, del quale esistono in circolazione alcune varianti.
Istruzioni per il calcolo:
1. entrare con la percentuale della “sabbia” sul lato “sabbia” e tracciare una linea parallela rispetto al lato “limo”
2. entrare con la percentuale del “limo” sul lato “limo” e tracciare una linea parallela rispetto al lato “argilla”
3. entrare con la percentuale della “argilla” sul lato “argilla” e tracciare una linea parallela rispetto al lato “sabbia”
Il punto dove si intersecano le tre linee ricade all’interno di un’area che individua il nome della classe a cui il terreno appartiene.

ARIA ED ACQUA NEL TERRENO

L’aria nel terreno ha solitamente un contenuto in ossigeno minore ed uno in anidride carbonica maggiore rispetto a quello dell’atmosfera a causa dei processi di respirazione ad opera dei macro- e microrganismi non fotosintetici del terreno.
Solo in situazioni di particolare anaerobiosi del terreno – ad esempio in forte carenza di ossigeno dovuta per esempio alla prolungata sommersione del terreno ed alla sua costipazione meccanica, il prevalere di processi di degradazione riduttiva (putrefazione) delle spoglie di piante ed animali può portare alla formazione di molecole quali metano, ammoniaca, idrogeno solforato e fosfina.
In un terreno adatto alla crescita della maggior parte delle piante, invece, l’aria dev’essere libera di circolare liberamente (terreno “leggero”).

condizioni di umidità nel terreno: grondante, “capacità di campo”, tipica, punto di appassimento

A differenza dell’aria, l’acqua nel terreno svolge una fondamentale funzione di media nella solubilizzazione, nel trasporto e nello scambio di specie chimiche, sia molecolari che ioniche, ad esempio dai siti di scambio ionico localizzati sulle particelle argillose – compresi i colloidi – ai peli radicali delle piante, rendendo possibile inoltre quel minimo di solubilità alla quale anche i componenti minerali dei quali sono costituite le sabbie possono andare incontro. L’acqua media inoltre i processi di redox nel terreno, solubilizzando per esempio l’ossigeno atmosferico, e gli stessi processi vitali dei microrganismi decompositori: senza acqua non c’è decomposizione microbiologica, ed in effetti uno dei migliori requisiti per un buon processo di “mummificazione” delle spoglie di un essere vivente è la carenza di acqua, per lo meno di quella che viene definita “acqua libera”, ovvero non semplicemente adsorbita idroscopicamente dalle particelle più idrofile dei materiali.
Lo stesso “punto di appassimento” corrisponde ad un contenuto di acqua residua nel terreno non superiore a quella adsorbita idroscopicamente sulla superficie delle particelle più piccole, siano esse minerali (argille) o organici, e nei loro capillari, dai quali neppure le radici delle piante – che pure sono ben disposte a spendere energia per estrarre acqua da un terreno, diciamo, poco meno che saturo di acqua – non sono più in grado di estrarla.   Quest’acqua capillare può ancora servire comunque a mantenere la coesione delle particelle di terreno, in virtù della forza dei legami idrogeno che riesce a stabilire fra esse, e può essere determinata analiticamente con tecniche quali la valutazione della perdita percentuale in peso conseguente all’essiccazione in forno di un campione di terreno.

LA COMPONENTE MINERALE DEL TERRENO

In principio era la roccia; la roccia era composta da più di un minerale – ed ogni minerale – con la sua composizione elementare, di struttura e la sua forma cristallina – era una sostanza chimica diversa.

orizzonti stratigrafici del suolo

Da questi miscugli eterogenei allo stato solido – le rocce appunto – si è pervenuti ed ancora si perviene, nel corso degli anni, talvolta dei secoli, ad un terreno che costituisce il substrato di ancoraggio, nutrimento e protezione per la maggior parte della vita sul nostro pianeta.
Il processo che porta la roccia originale a divenire essa stessa terreno prende il nome di pedogenesi (formazione del suolo) e coinvolge processi fisici, chimici e biologici.
Per quanto l’argomento sia di fatto insospettabilmente più complesso di quanto non possa a prima vista apparire, una delle condizioni essenziali affinché una roccia – entità per antonomasia solida e compatta – possa avviarsi a diventare terreno, o meglio la frazione minerale del terreno – passa attraverso il suo sgretolamento.
Non per niente la principale classificazione della frazione litica del terreno – che in pratica è quella minerale, inorganica – non fa tanto riferimento alla composizione chimica, quanto alla granulometria delle varie componenti di questa frazione.
Sabbia, limo ed argilla: queste le tre frazioni granulometriche del terreno, quelle che ci hanno trasmesso fin da piccoli dalla pagine del sussidiario.

La sabbia in fondo possiamo considerarla semplicemente alla stregua della roccia madre, opportunamente frantumata.
La roccia madre può essere quella sottostante il terreno sabbioso (che in questo caso si dirà autoctono), oppure può trovarsi in posti completamente diversi, come capita per i sassi, poi frantumati a ciottoli, poi frantumati a ghiaia e poi ridotti a sabbia trasportati dai fiumi, dai ghiacciai e, almeno per i corpuscoli più leggeri, anche dal vento.  I terreni cosiddetti alloctoni, godendo di una provenienza eterogena dei suoi corpuscoli sabbiosi, vantano solitamente una composizione chimica più variegata e, a parità di altre condizioni, riescono a fronteggiare meglio le molteplici esigenze di approvvigionamento minerale da parte delle piante.

tipi di terreno

Non possiamo tuttavia pensare che la suddivisione di una grande roccia nello stesso peso di fine sabbia non abbia conseguenze sulla sua composizione chimica: come in tutte le reazioni chimiche delle sostanze allo stato solido, anche la trasformazione chimica delle rocce ed in particolare dei minerali che le compongono avvengono unicamente alla superficie di questi e pertanto la velocità di questi processi – a parità di altre condizioni – avverrà proporzionalmente alla loro superficie di contatto con il fluido reagente, nel caso delle rocce con l’aria e con l’acqua.  A parità di peso complessivo, una roccia frantumata in sabbia avrà sia una superficie esposta dei singoli granelli di ordini di grandezza più estesa rispetto all’originale, sia una quantità di canalicoli fra un granello e l’altro sufficientemente grandi da lasciare circolare al loro interno sia l’acqua (con tutte le sostanze reattive che essa può sciogliere, ad iniziare dall’ossigeno e dall’anidride carbonica), sia una volta che quest’acqua sia scivolata via per gravità (in linguaggio tecnico si dice “percolazione”) l’aria stessa. Una sabbia contenente minerali del ferro in forma ridotta, il Fe(II), non tarderà molti anni a cambiare colore, assumendo almeno in superficie il color ruggine tipico del ferro ferrico, il Fe(III); e a chi dovesse obiettare che si tratta comunque di un’alterazione superficiale, ricordo che questa sabbiolina ormai ha assunto una superficie così grande che anche le alterazioni superficiali incidono ormai molto sulla composizione del bulk.
Nonostante questo la sabbia risulta essere comunque una riserva minerale a lunga scadenza – sebbene a lentissima cessione – di elementi minerali in forma ionica, maggiormente idrosolubile, al resto del terreno.  Riserva del tutto inutile, che rischia di percolare via negli strati profondi fino alle falde acquifere alla prima pioggia, se non incontra al suo fianco la capacità ritentiva idrica e ionica di un’altro componente essenziale di ogni buon terreno, l’argilla.

gli 8 elementi più abbondanti nella crosta terrestre

Tra i materiali minerali, o comunque inorganici, prevalgono solitamente i silicati e gli alluminosilicati, seguiti da carbonati, fosfati, idrossidi ed ossidi, seguiti da sali sempre inorganici idrosolubili quali solfati, cloruri e nitrati.  Tra i cationi prevalgono invece calcio, magnesio, sodio, potassio e ferro.
Consultando una tabella relativa all’abbondanza sulla crosta terrestre dei diversi elementi chimici della tavola periodica non si può infine rimanere sorpresi di come tra gli elementi più diffusi ne figurino alcuni di insospettabili, che siamo soliti associare a qualcosa di “esotico” o comunque di costoso, come ad esempio zirconio (0.013% crosta terrestre), titanio (9° elemento in abbondanza: 0.6% della crosta terrestre) e vanadio (0.014% della crosta terrestre).
Nel linguaggio geochimico tuttavia sono la norma molecole, o comunque unità strutturali, ben più complesse di quelle che vengono riportate ad esempio sui libri di chimica inorganica: la coesistenza nella stessa specie chimica di anioni di tipo diverso, come ad esempio negli allumino-silicati, e spesso anche di cationi diversi, con i monovalenti più facilmente scambiabili nei confronti dell’eventuale soluzione acquosa circolante.  A puro titolo di esempio si citano minerali come la biotite K(Mg,Fe)₃(AlSi₃O₁₀)(OH)₂, la clorite (Mg,Fe)₃(Si,Al)₄O₁₀(OH)₂•(Mg,Fe)₃(OH)₆ o la vesuvianite (o idrocrase) Ca₁₀(Mg,Fe)₂Al₄(SiO₄)₅(Si₂O₇)₂(OH)₄.
Quelle di dimensioni inferiori a 0,1μ hanno proprietà colloidali e hanno perciò un ruolo di interazione dinamica con gli altri componenti.

La frazione granulometrica del terreno per certi versi più difficile da descrivere è probabilmente il limo.  Difficile da affrontare sia perché a differenza di sabbia ed argilla, ed anche delle frazioni organiche come l’humus, è entrato solo marginalmente a far parte del nostro linguaggio e immaginario (per antonomasia quello che ci viene in mente era il limo fertile depositato dal Nilo nell’antico Egitto), sia perché questa componente minerale del terreno possiede caratteristiche intermedie fra quelle della sabbia e quelle dell’argilla.
Di primo acchito si potrebbe dire che la distinzione è ancora una volta su base granulometrica, e di fatto siamo soliti parlare di limo quando le particelle hanno un diametro equivalente sferico compreso fra i 2 micron (limite con l’argilla) ed il 75 micron (limite con la sabbia fine).  Di fatto la distinzione fondamentale, anche a parità di granulometria, è seppur indirettamente legata alla composizione chimica, o meglio alle proprietà fisico-meccaniche che da questa derivano: seppur molti fini, le particelle di limo non coedono fortemente le une alle altre – con il contributo di un film d’acqua di spessore talora molecolare – e non attribuiscono quindi alla massa del terreno le caratteristiche plastiche tipiche invece dei terreni argillosi.
Dal punto di vista geotecnico, il limo, è la frazione fine di terreno naturale sciolto che, a differenza dell’argilla, non possiede coesione e pertanto non ha un comportamento plastico.  La distinzione tra limo e argilla è pertanto legata, oltre che alla granulometria, al comportamento del materiale (plastico o non plastico), generalmente accertata con la determinazione dei limiti di Atterberg; cio nonostante molte norme tecniche tendono a definirlo anche dal punto di vista della dimensione dei grani, pur riconoscendo che la distinzione tra limo e argilla dal punto di vista granulometrico è meno significativa rispetto a quella condotta secondo la prova di plasticità.
Generalmente il limo comprende la frazione di terreno avente grani di diametro equivalente sferico inferiore ai 75 micron e superiore a 2 micron.

struttura molecolare di un materiale argilloso tipo fillosilicato

L’argilla infine è composta soprattutto da alluminosilicati, ed in questo rispecchia molto da vicino la composizione più ricorrente della stessa crosta terrestre, che tanto è ricca di questi due elementi – il silicio e l’alluminio, entrambe in forma anionica – da prendere nel gergo dei geologi da denominazione di “SiAl”. Anche se può apparire come una descrizione chimica per certi versi sufficiente, parlare di alluminosilicati significa a malapena definire le regole del gioco, in quanto gli alluminosilicati possono essere considerati alla stregua di eteropolimeri inorganici – le cui unità monomeriche sono appunto composte da silicati e da alluminati – organizzati fra loro in una possibilità pressoché infinita di combinazioni reciproche, ad iniziare proprio dalla dimensionalità stessa del polimero formato: monodimensionale (o per meglio dire lineare, a catena), bidimensionale (laminare, a fogli) e tridimensionale (estensione nello spazio).

Struttura chimica e granulometria minima attribuiscono alla frazione argillosa del terreno due fondamentali proprietà: quella di poter stabilire un’elevatissima quantità di legami idrogeno, specie sfruttando l’effetto ponte esercitato da strati molto sottili di molecole d’acqua, e quella di poter scambiare con facilità ioni, soprattutto cationi, fra i quali importanti elementi fitonutritivi (fra i quali potassio, magnesio, calcio, ecc) garantendo fra l’altro un certo effetto tampone nei confronti di repentine variazioni nelle condizioni di pH o anche semplicemente di concentrazione ionica dell’ambiente circostante.

terreni argillosi

La propensione a trattenere l’acqua porta invece con sé sia conseguenze favorevoli, come ad esempio il rallentamento della perdita per percolazione delle acque meteoriche, tipica invece delle sabbie ed anche un certo effetto plastico, dovuto allo scivolamento di particelle di argilla le une sulle altre per mezzo di quella sorta di lubrificante e al tempo stesso legante che è costituito dall’acqua: un effetto non simile a quello che si ottiene quando si prova a far scivolare fra le mani una manciata di palline magnetiche.  Questa plasticità si traduce spesso in una certa tenacia, in termini di attrito interno, con la quale il terreno si oppone ai fenomeno franosi, nei confronti dei quali la sabbia non ha scampo: la quantità di acqua che permette di ottimizzare questo effetto tuttavia è un fattore critico, perché al di sopra di un certo limite l’argilla viene semplicemente “lavata via” trasformandosi in un fango pressoché liquido, tristemente noto per i disastri causati a carico di abitazioni e strade costruite subito sotto pendii terrosi ed incolti. I valori limite relativi al contenuto di acqua al quale è possibile registrare una “transizione di stato” fisico del terreno (da solido a semisolido, e successivamente a plastico ed infine a liquido) sono un parametro importante e misurabile per ogni tipologia di terreno e prendono il nome di limiti di Atterberg.
Per quanto la componente minerale ed in generale inorganica del terreno possa contribuire alla sua struttura ed in particolare alla sua resistenza nei confronti dei processi erosivi e di dilavamento, il loro effetto risulta tutto sommato irrisorio se paragonato a quello che è in grado di esercitare la componente biotica, ed in particolare vegetale, tramite il suo apparato radicale diffuso nelle realtà più mature dagli strati più superficiali, quelli dell’erba, fino ad intaccare – o se vogliamo vederla così “ad ancorarsi” – alla roccia madre sottostante.

L’ODORE DEL TERRENO

Nonostante possano essere potenzialmente un numero indeterminatamente elevato le diverse specie molecolari che potrebbero contribuire all’odore del terreno, una in particolare emerge alla nostra attenzione, essenzialmente per via della sua estrema odorosità (meglio definibile come “soglia di percezione”, ovvero la minima concentrazione della sostanza che riusciamo a percepire, in questo caso con l’olfatto).
Si tratta della geosmina, una sostanza organica (precisamente un alcol terziario di tipo biciclico) prodotta da una grande varietà di microrganismi che vivono nel terreno.
L’odore della geosmina, opportunamente dispersa in quantità minime nell’aria, o anche nell’acqua, viene infatti descritto come odore di terreno. In particolare di quel terreno umido di sottobosco, fertile e ricco di sostanza organica in decomposizione, come in un bosco dopo la pioggia: non a caso la molecola è prodotta dal metabolismo di batteri decompositori d’eccellenza quali gli attinobatteri, specialmente quelli del genere Streptomyces, e da quello delle cosiddette alghe blu-verdi, meglio note come cianobatteri. Tutti microrganismi che richiedono per il loro sviluppo ottimale la disponibilità di acqua in quantità e che liberano i loro metaboliti secondari più odorosi, quali appunto la geosmina, in seguito alla loro morte cellulare.
La geosmina si accumula anche in piante ed animali che vivono a stretto contatto con fonti della stessa molecola: essa contribuisce infatti al gusto terroso caratteristico della barbabietola, così come al sapore di fango dei pesci che vivono nei fondali melmosi d’acqua dolce.
Quando l’acqua – pur potabile in funzione della sua composizione chimica e microbiologica – evidenzia un forte odore di terra o di muffa, la responsabilità è ancora una volta da ricercare nel più dei casi nella presenza della geosmina, eventualmente in presenza di un’altra molecola analoga a questa per origine e per intensità odorosa: il 2-metilisoborneolo.

fialetta contenente uno standard analitico di geosmina

La soglia di percezione olfattiva della geosmina da parte dell’uomo, tra le più basse fra le sostanze conosciute, è inferiore alle 5 parti per trilione. Un valore questo talmente minimale che fino a pochi anni fa la stessa strumentazione gascromatografica con i migliori detector del tempo non riusciva a trovare giustificazione – almeno in termini chimici – dell’odore di terra e di muffa riportato da molti consumatori sull’acqua di taluni acquedotti. Non a caso l’analisi organolettica “a naso” dell’odore era richiesta dallo stesso D.Lgs. 31/2001 “Attuazione della direttiva 98/83/CE relativa alla qualità delle acque destinate al consumo umano”.
Fortunatamente a venire incontro alle necessità del consumatore sempre più esigente (si ricorda infatti che la geosmina non può essere considerata “pericolosa” nelle concentrazioni minime che riescono ad essere percepite dall’olfatto) è la tradizione popolare: quella che ci spinge ad aggiungere aceto o limone – ovvero ad acidificare – i prodotti agricoli ricchi di questa sostanza, dalle barbabietole alle carpe.  La geosmina infatti si decompone facilmente a valori bassi di pH, formando prodotti di reazione pressoché inodori.

IL COLORE DEL TERRENO

Per quanto esistano terreni e terricci di colore diverso, dal nero al rosso, dal grigio al beige, credo che il colore che ciascuno di noi associerebbe con maggiore spontaneità alla terra sia certamente il marrone. Tonalità a parte, la maggiore o minore scurezza del colore è spesso condizionata da due semplici fattori, spesso trascurati nonostante la loro grande importanza ai fini della colorazione delle sostanze: la comminuzione (ovvero la pezzatura) e l’umidità.
Le sostanze bagnate, o comunque umide, appaiono nei più dei casi più scure, ed il terreno non fa certo eccezione a questa regola empirica: la terra bagnata appare più scura, e se la facciamo asciugare per bene, ad esempio sotto il sole o sul termosifone, potrà diventare chiara a tal punto da sembrare completamente un’altra sostanza.

terreni con ferro(II) ridotto, neri, e con ferro(III) ossidato, rossi

Per quanto riguarda la finezza delle particelle, si tratta probabilmente di un constatazione un po’ meno immediata e quotidiana, ma più noi sminuzziamo un prodotto colorato, fino a macinarlo molto fine, più esso risulterà chiaro. La ragione di questo fenomeno è legata alla riflessione della luce statisticamente in ogni direzione da parte delle particelle che, in gran numero nei prodotti molto fini, tendono ad essere direzionate rispetto ai nostri occhi in tutte le direzioni spaziali possibili.
Un contributo fondamentale nella determinazione del colore del terreno, specie nella sua componente argillosa, è da ricercarsi nel suo stato di ossidazione, con particolare riferimento alla componente minerale dei metalli di transizione: in primo luogo il ferro, secondariamente altri metalli quali il manganese.  Lo stesso terreno in condizioni di piena aerazione, purché ricco in ferro, con il passare del tempo tenderà al rossiccio tipico del ferro trivalente, mentre in condizioni riducenti (ad esempio in condizioni anaerobiche, specie in presenza di sostanza organica) tenderà al colore grigio-nero del ferro bivalente.  Si tratta in fondo dello stesso effetto sfruttato nelle antiche fornaci greco-romane per la decorazione dei vasi in argilla dei medesimi colori.

Sgomberato il campo dalle variazioni di luminosità attribuibili all’umidità, alla comminuzione ed allo stato di ossidazione dei metalli di transizione, resta dunque la domanda: a cosa è dovuto il colore marrone del terreno?
In una coppia di articoli pubblicati nel 2010 sempre su Chimicare.org (La chimica a colori: perché ossidandosi le sostanze spesso si scuriscono?) si descriveva come i colori corrispondenti allo spettro visibile della luce, specie ai colori a lunghezza d’onda superiore a quella del giallo, corrispondessero a strutture molecolari altamente coniugate, ovvero ricche di doppi legami alternati a legami semplici, di anelli aromatici e di gruppi carbonilici a loro volta coniugati a questi. Qualcosa in altre parole che lasciasse gli elettroni pi-greco dei doppi legami liberi di circolare su un orbitale molecolare il più esteso possibile. Al tempo stesso, chiunque di noi abbia provato a pasticciare un po’ con i colori a tempera si sarà reso conto di come il marrone sia un colore un po’ diverso dagli altri: il modo migliore per ottenerlo di solito è quello di mescolare, seppur in rapporti diversi, tutti e tre i colori primari dei quali disponiamo, ed anche in termini chimici – di spettroscopia molecolare – non troveremo mai un gruppo funzionale al quale corrisponde una specifica banda di assorbimento nel visibile, alla quale a sua volta corrisponde un colore visibile di tipo marrone.  Anche nel campo spettroscopico, questa gamma di colori, quelli che vanno dal beige al bruno fino al marrone scuro, corrispondono ad a spettri di assorbimento compositi, caratterizzati da bande di assorbimento che ricadono in porzioni diverse dello spettro elettromagnetico del visibile: una situazione questa che nel più semplice dei casi corrisponde a molecole dotate di più gruppi cromofori diversi fra loro, nel più complesso ad una miscela di sostanze contenenti gruppi cromofori diversi.

possibile struttura di un acido umico

Quando un chimico vede un campione marrone, comprende subito che non si tratta di una cosa semplice.   Infatti, pur volendo escludere – cosa non facile – il contributo della frazione inorganica alla colorazione del terreno e volendo riconoscere alla frazione organica la gran parte effettiva del contributo, ci troviamo al cospetto di qualcosa del tutto diverso da quello che si potrebbe definire una sostanza chimica.   Le molecole organiche che si formano dalla decomposizione delle spoglie degli organismi viventi nel terreno, formano infatti una varietà ed una possibilità di combinazioni che probabilmente è superata soltanto da quella riscontrabile negli organismi vivi.  A differenza che in questi, tuttavia, i meccanismi di formazione sono tutt’altro che concertati e la variabilità di condizioni microbiologiche, redox, enzimatiche, idriche, e così via riscontrabile puntualmente nel terreno fa si che la gamma di molecole organiche che si possono formare nel processo di degradazione, fino all’eventuale mineralizzazione, degli esseri ex-viventi, sia potenzialmente infinita.   Sia che si voglia considerare l’humus propriamente detto che le sue frazioni, diciamo, “un po’ più chimiche” come gli acidi umici ed in particolare la sua frazione idrosolubile nota come acidi fulvici, quello che notiamo è l’abbondanza di sistemi molecolari coniugati.

acidi umici allo stato solido e dispersi in acqua

Anelli aromatici e gruppi chinonici, eterocicli aromatici e gruppi carbossilici e fenolici, che chelano spesso metalli di transizione: quello che sembra accomunare maggiormente queste classi estremamente complesse di molecole, insieme alla variabilità e ad un contenuto di ossigeno via via crescente in funzione dell’avanzamento del processo di mineralizzazione, è l’estensione della coniugazione del sistema.  Una condizione questa che crea il presupposto per un’accavallarsi di bande di assorbimento in praticamente tutte le regioni dello spettro del visibile (e non solo), con il risultato di un bel colore nero…  che solo la diluizione con la componente minerale e poco altro permetterà di stemperare in un rassicurante marrone.