La chimica del fegato: le Transaminasi ed i test chimico-clinici che indicano una lesione delle cellule epatiche

di Sergio Barocci

posizione del fegato nel corpo umano(Vedi anche l’articolo, dello stesso Autore: “L’interpretazione delle analisi di laboratorio e degli esami strumentali nelle malattie epatiche“)
A causa delle molteplici funzioni che il fegato svolge ( ruolo cruciale nel metabolismo glucidico, lipidico e proteico e ruolo detossificante ) e la complessità dei danni anatomo – funzionali presenti nelle diverse patologie epatiche , risulta chiaro che non può esistere un singolo esame di laboratorio che sia da solo in grado di mettere in evidenza tutte le possibili alterazioni di quest’organo.
In genere, nella pratica quotidiana, vengono utilizzati più test di laboratorio chimico – clinici configurati in modo da rilevare i diversi aspetti della patologia epatica , quali ad esempio la sua natura e la sua gravità, il tipo di danno e la compromissione della funzionalità del fegato.

Questi test denominati di 1° livello o di screening, comprendono una serie di esami del sangue che servono a valutare :

a)  le attività enzimatiche , seriche di possibile origine epatocitaria come GOT o AST, GPT o ALT dette anche transaminasi , ALP (fosfatasi alcalina) , g-GT (gamma-glutamil transferasi);
 
b)  la bilirubina totale e frazionata nel sangue;

c)  le proteine plasmatiche (stimate come quantità totale, albumina, globuline);

d)  alcuni fattori della coagulazione ( tempo di protrombina o PT , tempo di tromboplastina parziale attivata o aPTT, fibrinogeno ).

medici e infermieri

I professionisti storici del Laboratorio di analisi chimico –cliniche ( medici e infermieri). Oggi si sono aggiunte altre professionalità come i tecnici di laboratorio ( laurea triennale) , i biologi e i chimici ( con specialità nelle singole discipline)

Quindi, fondamentalmente le finalità di queste indagini servono ai seguenti scopi:

a)  indicare eventuali danni epatici in seguito ad infiammazione e necrosi;

b)  indicare la presenza di colestasi e vanno pertanto sotto il nome di indicatori di danno epatocellulare;

c)  misurare le capacità sintetiche da parte del fegato (costituiscono delle vere prove di funzionalità epatiche);

d)  individuare la causa della malattia;

e)  valutare la risposta al trattamento.

Pertanto, una volta differenziati i principali quadri clinici del fegato (ostruzione del tratto biliare, danno acuto epatocellulare, malattia epatica cronica) occorrerà poi eseguire dei test specialistici di 2° livello, quali:

a)   i marcatori specifici dell’epatite virale (HAV, HBV, HCV, HDV);

b)   il dosaggio dell’α-1 fetoproteina o AFP ( il cui valore si eleva nel caso di un sospetto carcinoma epatocellulare);

c)   la determinazione della sideremia, ferritina e capacità ferro-legante, cupremia e cupruria, ceruloplasminemia rispettivamente nei casi di sospette malattie da accumulo come emocromatosi (malattia metabolica genetica dovuta all’accumulo di notevoli quantità di ferro in diversi organi e tessuti quali fegato, pancreas, cute, cuore, e alcune ghiandole endocrine) e morbo di Wilson (disordine genetico trasmesso in modo autosomico recessivo che determina l’accumulo di rame nei tessuti) e di marcatori specifici dell’autoimmunità nel corso di malattie autoimmuni (cirrosi biliare primitiva ,colangite sclerosante primitiva, epatite autoimmune) come la rilevazione di anticorpi del tipo AMA (anti-mitocondri), ANA (anti-nucleo), ASMA (anti-muscolo liscio), p-ANCA (anticorpi citoplasmatici antineutrofili perinucleari), LKM-1 (anti-citocromo P450 2D6), SLA/LP (anti-antigene solubile epatico), LC-1 (anticorpi anti – citosol epatico tipo 1).

 Numerosissimi sono gli esami di laboratorio utilizzati per porre diagnosi di malattia del fegato e per specificarne l’origine.

 

Tra i test che indicano una lesione o necrosi (morte) delle cellule epatiche, un approfondimento particolare meritano senz’altro le tansaminasi.


Transaminasi

Le transaminasi (o aminotransferasi) sono una sotto-sottoclasse di enzimi appartenenti alla classe delle transferasi che catalizzano il cosiddetto processo di transaminazione, cioè quel processo reversibile per cui un aminoacido (R−NH2−COOH) trasferisce, senza liberazione di ammoniaca, il proprio gruppo aminico ad un α-chetoacido (R−CO−COOH) con conseguente formazione del chetoacido e dell’aminoacido corrispondenti rispettivamente all’aminoacido e al chetoacido primitivi (aminotransferasi).
Le più note aminotransferasi sono rappresentate rispettivamente dalla:

a)   glutammato-ossalacetato transaminasi, GOT, detta anche aspartato aminotransferasi AST;

b)   glutammato-piruvato transaminasi, GPT, detta anche alanina aminotransferasi ALT.

Struttura  tridimensionale dell’ Aspartato transaminasi  ( GOT o AST)  con  il  Piridossalfosfato  come cofattore

Struttura tridimensionale dell’ Aspartato transaminasi ( GOT o AST) con il Piridossalfosfato come cofattore

GOT o AST e GPT o ALT sono enzimi di interesse diagnostico (epatite, cirrosi, infarto miocardio), perché si ritrovano in quantità elevata nel siero a seguito di un danno cellulare epatico o muscolare. Inoltre, poiché la GOT o AST è un enzima mitocondriale mentre la GPT o ALT fa parte del citosol, un danno cellulare lieve libererà attività GPT o ALT mentre un danno cellulare grave (con rottura anche dei mitocondri) libererà anche attività GOT o AST.

Dal rapporto GOT/GPT nel siero, è possibile ricavare informazioni sulla gravità del danno cellulare.   In molti casi di malattie epatiche causate da virus, il rapporto GPT o ALT/GOT o AST è > a 1, mentre nelle forme di origine alcolica o tossica l’aumento sierico della GOT o AST è maggiore della GPT o ALT (rapporto GPT/GOT < a 1).

Anche cause extraepatiche possono alterare il valore delle transaminasi nel sangue specialmente con un esercizio fisico intenso e in presenza di lesioni muscolari così come alcuni farmaci (antibiotici, anti-infiammatori) e preparati erboristici.   In generale, la specificità delle transaminasi è proporzionale all’entità dell’aumento.   Se questo supera di dieci volte il limite superiore di riferimento si può escludere la presenza di patologie muscolari di origine infiammatoria o degenerativa ( aumento quasi esclusivamente della GOT) e ci si orienta verso un più probabile danno epatocellulare.   L’attività transaminasica sierica viene determinata con metodi spettrofotometrici e colorimetrici.   I primi misurano la diminuzione di estinzione cui va incontro il sistema di reazione per la deidrogenazione del difosfopiridinnucleotide ridotto (cozimasi ridotta o codeidrasi I ) che si verifica per permettere la riduzione, in presenza di deidrogenasi malica o di deidogenasi lattica, dell’acido ossalacetico (ossalacetato) o rispettivamente dell’ acido piruvico (piruvato) , formatosi in seguito a transaminazione. in acido malico o malato (nel 1° caso) o in acido lattico o lattato (nel 2° ).

I metodi colorimetrici, meno esatti ma più pratici, invece determinano la quantità di acido piruvico formatasi previa trasformazione del chetoacido nel corrispondente fenilidrazone. Come unità transaminasica è stata adottata quella spettrofotometrica proposta da F. Wroblewski e I. S. La Due, che corrisponde ad una diminuzione di estinzione di 0,001 per 1 cm3 di siero al minuto e alla lunghezza d’onda di mμ 340. Per quanto riguarda i valori normali delle transaminasi, essi vengono indicati nei referti di laboratorio e variano a seconda della metodica analitica adottata.   Da notare che negli adulti gli intervalli di riferimento della GOT e della GPT variano con il sesso e impiegando metodi standardizzati, i limiti superiori di riferimento risultano rispettivamente 31 U/l (sesso femminile) e 35 U/l (sesso maschile) per GOT o AST e 34 U/l (sesso femminile) e 45 U/l (sesso maschile) per GPT o ALT.   Nei bambini fino ai 16 anni l’attività della GOT è lievemente più alta di quella della GPT ed è per questo che dovrebbero essere richiesti limiti di riferimento separati da quelli degli adulti.

Mario ColtortiMario Coltorti (1926 – 2009) (alla sinistra della foto ) insieme a Giuseppe Giusti e a Fernando De Ritis ( 1911 – 1985 ) scoprì nel 1955 all’Università di Napoli la “sindrome enzimoplastica” della epatite virale, dimostrando che tale infezione virale è in grado di realizzare delle modalità particolari che possono essere espresse mediante degli “indici rivelatori del danno” come l’aumento sierico delle transaminasi. La presenza di questi indici è molto utile per la diagnosi di infezione virale. La scoperta di queste attività enzimatiche epatiche , ha contribuito a precisare il contributo della enzimologia clinica quale scienza applicata alla diagnostica delle malattie epatiche trovando anche applicazioni forse ancor più importanti nel campo della profilassi, della epidemiologia e della terapia”. 

Ma quali sono le cause di un innalzamento delle transaminasi ?

A.   Valori estremamente elevati (> 500 UI/l) indicano una necrosi acuta delle cellule del fegato o un danno epatico dovuto a:

  • epatite virale acuta
  • epatite indotta da tossine o farmaci
  • epatite ischemica o infarto del fegato

In questi casi i livelli di GPT o ALT e GOT o AST risultano elevati per giorni o, in caso di epatite virale, anche per settimane.  I livelli delle transaminasi possono risultare elevati anche in caso di:

  • inasprimento di epatite autoimmune
  • riattivazione di epatite B cronica
  • sindrome acuta di Budd-Chiari
  • steatosi epatica della gravidanza
  • passaggio di un calcolo nel dotto comune

B.   Aumenti modesti da 300UI/l a 500 UI/l si osservano specialmente nei disturbi epatici cronici (epatite cronica e alcolica) e nell’ostruzione biliare.

C.   Aumenti lievi

  • cirrosi secondaria a epatite virale
  • cirrosi epatica per qualsiasi causa
  • steatosi non alcolica
  • disturbi colestatici
  • epatocarcinoma

 

Valori delle transaminasi in diverse malattie epatiche (Mod da Giannini EG, 2005)

Valori delle transaminasi in diverse malattie epatiche (Mod da Giannini EG, 2005)

D.   Livelli aumentati di GOT o AST se osservati anche a livello cardiaco, renale, pancreatico e dei muscoli scheletrici, possono riflettere anche un danno a uno di questi organi.

E.   Inoltre, esistono casi in cui i valori delle transaminasi possono risultare normali anche in presenza di disturbi epatici come ad esempio:

  • nell’ emocromatosi
  • nel danno epatico da farmaci (metotressato o amiodarone)
  • nell’ epatite C cronica o cirrosi
  • nella steatosi non alcolica

 

La reazione di transaminazione

Alimenti ricchi di pridossale e molecole ad essa correlate

Alimenti ricchi di pridossale e molecole ad essa correlate

Il fegato è il principale organo di degradazione degli aminoacidi e la reazione di transaminazione rappresenta la prima tappa del catabolismo aminoacidico in cui il gruppo aminico in posizione α di molti aminoacidi ( α- aminoacidi) viene trasferito ad un α- chetoacido (α-chetoglutarato) per formare lo ione ammonio NH4+.  Nelle cellule esistono molti tipi di transaminasi le quali utilizzano α-chetoglutarato come accettore del gruppo amminico ma divergono tra loro per la specificità nei confronti dell’amminoacido utilizzato.  Le reazioni catalizzate da tali enzimi sono tutte facilmente reversibili (la loro K di equilibrio, in effetti, è molto vicina ad 1).

Amminoacido (1) + α-Chetoacido (1)   ⇔  
⇔   α-Chetoacido (2) + Amminoacido (2)

Più precisamente, la aspartato aminotransferasi GOT o AST (uno dei più importanti di questi enzimi) catalizza il trasferimento del gruppo aminico dall’aspartato all’α-chetoglutarato.  

Aspartato + α -chetoglutarato   ⇔   ossalacetato + glutamato

e l’alanina aminotransferasi GPT o ALT che rappresenta anche l’enzima più rappresentato nei tessuti di mammifero, catalizza il trasferimento del gruppo aminico dell’alanina all’α-chetoglutarato

Alanina + α -chetoglutarato   ⇔   piruvato + glutamato

reazione di transaminazione

Lo ione NH4+ si forma dal glutamato mediante deaminazione ossidativa, una reazione catalizzata dalla glutamato deidrogenasi che ha una particolarità a differenza di altre deidrogenasi di utilizzare entrambi i trasportatori di elettroni nelle ossidazioni delle sostanze nutrienti NAD+ (nicotinammide adenin di nucleotide ) e NADP+ (nicotinammide adenin di nucleotide fosfato).   La somma delle reazioni catalizzate dalle aminotransferasi e dalla glutamato deidrogenasi è la seguente :

α-aminoacido + NAD+ ( o NADP+) + H2O   
⇔   α-chetoacido + NH4+ + NADH ( o NADPH) + H+
 

piridossal-5'-fosfato

piridossal-5′-fosfato

Nella maggior parte dei vertebrati lo ione ammonio NH4+ sarà convertito in urea che viene escreta.  Il gruppo prostetico di tutte le amino transferasi è rappresentato dal piridossal 5’ fosfato o PLP che deriva dalla piridossina (Vitamina B6).   La piridossina, il piridossale e la piridossamina sono le forme con cui si presenta la vitamina B6.  Tutte e tre sono derivati piridinici che si differenziano tra di loro per i diversi gruppi funzionali sostituenti che si trovano, rispetto all’atomo di azoto, in posizione para.

Durante la transaminazione il PLP viene convertito temporaneamente in piridossamina fosfato o PMP.   Gli enzimi che utilizzano il PLP formano legami covalenti con i loro substrati formando intermedi contenenti basi di Schiff con il gruppo α-aminico di uno specifico residuo di lisina presente nel sito attivo.   In presenza dell’aminoacido substrato si viene a formare un nuovo legame tipo base di Schiff.  L’α-aminogruppo dell’aminoacido substrato si sostituisce al gruppo aminico ε della lisina del sito attivo; cioè, un aldimmina interna diventa un’aldimmina esterna.  La base di Schiff che si forma tra l’aminoacido e il PLP rimane saldamente legata all’enzima mediante interazioni multiple non covalenti.

base di Schiff

PLP legato ad aminoacido via base di Schiff

Esmond Snell (1914-2003) e Alexander Braunstein (1902–1986) proposero tra gli anni ’40 e gli anni ’50 un meccanismo di reazione per le transaminasi che ha dimostrato ancora oggi la sua validità.

Esmond Emerson SnellEsmond Emerson Snell (1914–2003), biochimico statunitense e pioniere nella ricerca nutrizionale. Scoprì le due nuove forme di vitamina B 6 , piridossale e piridossamina , portando alla comprensione delle reazioni chimiche della vitamina B 6 e del meccanismo catalitico degli enzimi B 6 dipendenti.

La base di Schiff che si forma tra l’aminoacido substrato e il PLP chiamata aldimmina esterna, perde un protone dal suo carbonio α formando un intermedio chinonoide .
La riprotonazione produce una chetimmina che contiene un doppio legame tra l’atomo di N e l’atomo di C del substrato.  Al contrario , l’aldimmina contiene un doppio legame tra tra l’atomo di N e il C carbonilico del PLP. La chetimmina viene quindi idrolizzata ad α-chetoacido e piridossamina fosfato.
Tutti questi passaggi costituiscono metà della reazione complessiva di transaminazione :

Amminoacido (1) + Enzima-Piridossal fosfato (E-PLP)     ⇔
⇔     α-Chetoacido (1) + Enzima-Piridossammina fosfato (E-PMP)

La seconda metà avviene con reazioni inverse rispetto alle precedenti. Un secondo α-. chetoacido reagisce con il complesso enzima piridossamina fosfato ( E-PMP) per formare un secondo aminoacido e rigenerare il complesso enzima piridossal-fosfato (E-PLP)

α-Chetoacido(2) + E-PMP   ⇔   aminoacido (2) + E-PLP

La somma di queste reazioni parziali è la seguente :

Amminoacido (1) + α-Chetoacido(2) ⇔ aminoacido (2) + α-Chetoacido (1)

Ugo SchiffUgo Schiff (1834-1915), fu un chimico tedesco naturalizzato italiano e allievo di Friedrich Wöhler (1800-1882) (realizzò per primo la sintesi dell’urea) all’Università di Gottinga.
Nel 1863, per interessamento del chimico – fisico italiano C. Matteucci (1811-1868) , fu chiamato ad insegnare chimica presso il Museo di Fisica e Storia Naturale di Firenze, dove rimase fino al 1876, quando venne chiamato alla cattedra di chimica generale dell’Università di Torino.
Nel 1879 tornò a Firenze, occupando la cattedra di chimica dell’Istituto di Studi Superiori e conducendo importanti studi sui glucosidi, sugli acidi polibasici e sul furfurolo.
Fra le altre sue scoperte,sono da ricordare i prodotti di condensazione delle aldeidi e delle ammine con l’anilina, successivamente noti come basi di Schiff.
Nel 1876 pubblicò il testo “Introduzione allo studio della chimica”. Contribuì a fondare una delle più importanti scuole di chimica in Italia. Con Stanislao Cannizzaro ed Emanuele Paternò, fu tra i fondatori della Gazzetta Chimica Italiana.

 

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 (Vedi anche l’articolo, dello stesso Autore: “L’interpretazione delle analisi di laboratorio e degli esami strumentali nelle malattie epatiche“)

 

 

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