Risonanza Magnetica Nucleare (2° parte): le applicazioni

di Nicole Ticchi

Alcuni atomi, inseriti in un campo magnetico e sottoposti a irraggiamento con onde radio, sono in grado di emettere segnali che ci forniscono preziose indicazioni sul loro intorno chimico e, in definitiva, sulla molecola cui appartengono.  Fa differenza quindi, se di fianco ad un carbonio o ad un idrogeno troviamo un ossigeno, un benzene o un altro atomo?  Assolutamente sì, ed è proprio tale differenza che ci permette di capire cosa ci troviamo di fronte.

schema di un NMR

schema di un NMR

Abbiamo visto nel precedente articolo [Introduzione all’NMR: come dialogano atomi e magneti] come questa tecnica sia preziosa per studiare la struttura di una molecola, per capire come sono legati tra loro gli atomi e per discriminare tra specie apparentemente molto simili.  Il chimico organico utilizza quotidianamente l’NMR; come già detto, ciò gli consente di dare un volto a ciò che ha ottenuto da una reazione o da una purificazione di matrici di vario genere.  Ma non è tutto.  Il quadro delle possibili applicazioni di questa tecnica è variegato e variopinto, con una considerevole flessibilità che permette di esplorare la scienza in tutte le sue espressioni.  Vedremo di seguito alcuni tra gli utilizzi più consolidati e frequenti, che coprono un ampia gamma di ambiti, dalla medicina all’agro-alimentare.

 

Medicina e dintorni: un macro-esperimento

Se pensiamo che le molecole più semplici, naturali o sintetiche che siano (non c’è tutta questa differenza, l’NMR lo dimostra), possono organizzarsi e dare a vita a strutture via via più complesse fino ad arrivare a macro-strutture, organi e apparati, possiamo facilmente immaginare che la possibilità di studiare la struttura tramite NMR possa essere estesa anche a questo tipo di sistemi.  Proprio così.  D’altronde, in medicina la risonanza magnetica è ormai tra le tecniche diagnostiche più diffuse, non a caso, proprio per ottenere informazioni sullo stato degli organi all’interno del nostro organismo.  Con questa tecnica è infatti possibile “fotografare” l’interno del nostro corpo, limitatamente all’area di nostro interesse, e riscontrare eventuali anomalie nella forma dell’organo.  Molto utilizzata e gettonata, questa tecnica non invasiva rappresenta un fiore all’occhiello nel progresso tecnologico in ambito medico: fornisce immagini dettagliate del corpo umano e, grazie a ciò, molte patologie e alterazioni a carico degli organi interni possono essere visualizzate e facilmente diagnosticate.  Come funziona?
risonanza magneticaFacciamo un piccolo passo indietro e cerchiamo di capire quale differenza c’è tra risonanza magnetica e lastre con irradiazione da raggi X, altra tecnica estremamente comune in diagnostica.  Se vi ricordate il campione da analizzare viene inserito, opportunamente diluito in adatto solvente, nello spettrometro e alloggiato all’interno di un magnete, rappresentato sempre più spesso da una bobina di un materiale superconduttore.  Qui, sottoposto a campo magnetico e ad irraggiamento, emetterà una certa quantità di energia che, raccolta da un rivelatore ed elaborata a dovere, darà origine ad un segnale a noi utile per lo studio strutturale.  La stessa cosa avviene, con le dovute proporzioni, al paziente che si sottopone ad una RM.   Il paziente, infatti, viene introdotto all’interno della macchina, costituita da un tubo abbastanza largo e non troppo stretto, aperto alle due estremità, dotato di apparecchiature accessorie, dove viene irradiato da un campo magnetico ad elevata intensità.   All’interno della macchina, le forze generate nel campo magnetico fanno sì che i momenti magnetici dei singoli atomi che compongono l’organismo, o la parte di esso coinvolta, si allineino con la direzione del campo indotto, inducendo temporanee alterazioni dei nuclei che, una volta interrotte le onde radio, tornano alla normalità generando segnali.  Questi vengono trasmessi ad un computer e trasformati in immagini tridimensionali, nelle quali i tessuti presentano colorazioni differenti: sono infatti di colore chiaro se ricchi di acqua, grazie all’abbondante presenza di atomi di idrogeno e scuri se ne sono poveri.  In alcuni casi, in relazione al tipo di patologia da studiare e alle circostanze specifiche, viene somministrato al paziente un mezzo di contrasto per via endovenosa: non è altro che una sostanza in grado di visualizzare in modo migliore una determinata regione da analizzare.  In particolare, alterando il contrasto di un organo o di qualsiasi altra struttura rispetto a ciò che la circonda, è possibile rendere visibili dettagli altrimenti non apprezzabili.  Nella RM i parametri che influenzano il segnale sono legati non solo alla densità ma soprattutto al rilassamento protonico, fattore che ha reso possibile sviluppare prodotti in grado di incrementare sensibilmente il contrasto tra tessuto normale e tessuto patologico anche a bassissima concentrazione.  Infatti mentre i mezzi di contrasto (generalmente organo-iodato) utilizzati in tomografia computerizzata, meglio conosciuta come TAC, bloccano direttamente i fotoni che attraversano l’organo bersaglio, in RM i mezzi di contrasto influenzano i tempi di rilassamento T1 e T2 dei protoni disposti in loro adiacenza, in modo tale che una singola molecola di mezzo di contrasto esplichi la sua azione su un numero elevatissimo di protoni a concentrazioni nettamente inferiori a quelle necessarie in diagnostica TC.  I mezzi di contrasto in RM sono costituiti da atomi o molecole in grado sia di incrementare il segnale sia di abbassarlo; tale effetto è ottenuto modificando localmente le proprietà del campo magnetico tramite sostanze con proprietà ferromagnetiche, paramagnetiche o diamagnetiche.  Si tratta di sostanze che possiedono la capacità di orientarsi nella direzione del campo magnetico o sono in grado di acquisire tale capacità in determinate situazioni.

TAC con mezzi di contrasto per l'encefalo

immagini da TAC con mezzi di contrasto per l’encefalo

Fra i mezzi di contrasto più utilizzati vi sono il gadolinio (elemento chimico con numero atomico 64), per le caratteristiche paramagnetiche del suo ione Gd3+, che viene usato in soluzione e complessato da leganti ciclici onde evitare la tossicità dello ione libero; il suo utilizzo è preferenziale come mezzo di contrasto extracellulare o per valutare l’integrità della barriera ematoencefalica.  Vi è poi l’ossido di ferro, le cui particelle sono selettivamente captate dal sistema reticolo-endoteliale, quindi da fegato, midollo osseo e milza; anche l’emoglobina, naturalmente presente nel nostro corpo, in quanto coinvolta nel trasporto dell’ossigeno e dell’anidride carbonica nel sangue, può agire da agente di contrasto e proprio la sua azione gioca a nostro favore.  Infatti, dato che le sue proprietà magnetiche variano a seconda del grado di ossigenazione della molecola, questa proprietà viene sfruttata per visualizzare le aree di tessuto ossigenate o meno, rivestendo una grande importanza principalmente nella risonanza magnetica funzionale.
Come abbiamo avuto modo di intuire quindi, con la RM sono ben visibili i tessuti molli ed è possibile la discriminazione tra tipologie di tessuti, talora non apprezzabile con altre tecniche radiologiche; a questo proposito, la Risonanza Magnetica può essere usata per la diagnosi di una grande varietà di condizioni patologiche che vede coinvolti gli organi e i tessuti del corpo.  E’ particolarmente utile per lo studio dei tessuti ricchi di acqua e quindi di atomi di idrogeno, meno per l’esame delle strutture anatomiche ‘dure’, quindi carenti di acqua come le ossa.  Risulta vincente, per esempio, nella diagnosi delle malattie del cervello e della colonna vertebrale, degli organi dell’addome, dei vasi sanguigni principali e del sistema muscolo-scheletrico.  La presenza di acqua, quindi in definitiva di idrogeno, è fondamentale ai fini della rilevanza di tale tecnica.
Ora che abbiamo capito come viene svolta una risonanza magnetica e su quali principi si basa sicuramente ci farà meno paura.  E se possiamo studiare e “scansionare” i nostri organi purché siano ricchi di acqua, perché non applicare la stessa tecnica anche alle cellule, che non mancano certo di fluido al loro interno?

 

Studi in vivo e metabolomica: una tecnica non invasiva

Un vantaggio inestimabile dell’impiego della spettroscopia di risonanza magnetica nucleare NMR nello studio delle cellule è proprio la non invasività e, di conseguenza, il fatto che non si verifichi una perturbazione dell’ambiente cellulare.  Con questa tecnica è possibile compiere sofisticati studi nei sistemi cellulari in condizioni simili a quelle naturali, con l’opportunità di poter osservare gran parte delle reazioni che avvengono all’interno delle cellule viventi.  Non a caso i nuclei più studiati come C, N, P e H costituiscono gli elementi fondamentali di tutte le molecole presenti nel nostro organismo!  Pensiamo ad una delle reazioni più importanti, che avviene in continuo nel nostro organismo, in ogni singola cellula ad un ritmo iper-sostenuto: la respirazione cellulare, con conseguente produzione di energia sottoforma di ATP.  Il fosforo, indicato come 31P, presente in composti molto importanti per il metabolismo della cellula, quali appunto ATP, ADP, esteri fosforici e fosfato inorganico, dà origine a segnali notevolmente intensi, che permettono di seguire la concentrazione di questi composti in cellule viventi ma anche in tessuti ed in vivo.  La presenza di fosfato inorganico, che si genera per idrolisi dei composti fosforati ad alta energia, ci fornisce una serie di importanti informazioni: ad esempio, lo ione PO43- è protonato in modo diverso in funzione del pH e ai valori normalmente presenti nella cellula predominano le specie H2PO4- e HPO42-.
Cosa rende possibile il loro studio in NMR?   Il fatto che tali specie sono caratterizzate da un diverso chemical shift.  Esse, a causa del rapido scambio del protone, presentano una unica banda con spostamento chimico è una funzione del pH.  Ecco come il chemical shift del fosfato inorganico può fornirci una misura del pH accurata e molto utile; inoltre, la diversa suscettibilità magnetica dell’ambiente intra ed extracellulare influenza il chemical shift di nuclei come il 31P ed il 19F, che nei due diversi ambienti è notevolmente diverso permettendo così di calcolare in una unica misura il pH sia intra che extracellulare.  Altri gruppi di reazioni molto interessanti da studiare con la spettroscopia NMR sono la glicolisi e il ciclo di Krebs all’interno delle cellule, utilizzando biomolecole marcate con 13C, seguendo la comparsa del tracciante nei composti intermedi e misurando la velocità delle reazioni cui prendono parte questi composti.  La spettroscopia NMR permette di misurare in tempo reale il decorso di queste reazioni. Se dovessimo estrarre questi composti dalle cellule ciò comporterebbe tempi molto superiori, perdita significativa di sostanza e, in definitiva, risultati non affidabili.  Ma non solo. A nche studi in vivo sono possibili, per esempio per monitorare il metabolismo durante l’ esercizio.  Monitorando i derivati fosforici è possibile determinare i livelli di ATP, fosfocreatina e il pH per capire le dinamiche con cui viene creata l’energia necessaria a supplire allo sforzo fisico.

HR-MAS NMR per studio metabolomico

HR-MAS NMR per studio metabolomico

Rimanendo in campo medico, un’importante approccio alla diagnosi di patologie o anomalie nell’organismo che ha visto un forte sviluppo negli ultimi tempi è la metabolomica, ovvero lo studio del set completo di metaboliti, molecole con peso molecolare solitamente inferiore ai 1500 kDa, presenti in un determinato campione biologico.   Perché è importante questo aspetto?   La possibilità di diagnosticare stati patologici, la loro progressione e l’efficacia dei trattamenti attraverso la conoscenza dei meccanismi molecolari che stanno alla base di una malattia è un obiettivo quanto mai ambizioso e molto difficile da raggiungere.  Molte patologie hanno un carattere complesso e multifattoriale e la loro diagnosi non può basarsi soltanto sulla valutazione di un singolo marcatore molecolare.  Questo fa sì che acquistino molta importanza approcci volti alla definizione di un profilo molecolare dei singoli individui, a partire da geni, RNA, proteine e metaboliti.

 

HR-MAS NMR: un angolo magico per tante applicazioni

La spettrometria di massa e la risonanza magnetica nucleare sono le metodiche tecnologiche più utilizzate in metabolomica.   Permettono di acquisire informazioni dettagliate e preziose in merito alle classi di molecole e alle strutture e pesi molecolari dei singoli metaboliti in condizioni diverse.   Lo studio del profilo metabolico via NMR, in particolare, ha il vantaggio non richiedere manipolazione del campione sia in caso di fluidi biologici sia in caso di tessuti e cellule.   In quest’ultimo caso si utilizza una modalità operativa particolare, chiamata HR-MAS NMR, acronimo per “high-resolution magic angle spinning”, che permette di indagare su materiali con una consistenza tra solido e liquido.  E quale applicazione migliore se non quella di studiare i tessuti molli o le cellule?

angolo magico

angolo magico

Il principio di questa tecnica si basa sul fatto che facendo ruotare il campione con un’inclinazione tale da formare un angolo θm , detto appunto angolo magico, con la direzione del campo magnetico, le linee dello spettro più esterne diventano più strette, con un cospicuo guadagno in risoluzione, maggior semplicità nell’analisi dello spettro e nell’identificazione del composto.
L’applicazione di questa tecnica inizialmente era concentrata quasi esclusivamente sull’analisi di molecole organiche su fase solida e sintesi peptidica o analisi di prodotti da chimica combinatoriale in fase solida. Si tratta a dire il vero di una tecnica che sta assumendo sempre più importanza negli ultimi anni, grazie alla quale si è in grado di compiere studi di notevole importanza in ambito chimico qualora si voglia studiare la struttura di una specie in fase solida.   Si pensi, ad esempio, al polimorfismo e alle problematiche ad esso connesse, in ambito chimico-farmaceutico in primis: questa tecnica ci offre la possibilità di ottenere risultati estremamente interessanti e utili al fine di evidenziare differenze anche minime tra i diversi polimorfi, dettagli difficili da evidenziare con altre tecniche.
La carta vincente della spettroscopia NMR allo stato solido rispetto a quella in soluzione è data dalla capacità di dare informazioni strutturali anche su composti di cui non è possibile ottenere la struttura dai raggi X, come campioni in polvere che presentano cristallinità a breve raggio o amorfi o, ancora, atomi di idrogeno, in particolare quando danno origine alle interazioni di legame idrogeno.   Questa ricchezza di informazioni, d’altro canto, ha rappresentato la fonte dei problemi che inizialmente avevano impedito la diffusione di questa tecnica allo stato solido.  La spettroscopia NMR misura le componenti delle interazioni magnetiche lungo la direzione del campo statico applicato, quali l’interazione Zeeman, l’interazione dipolare, l’interazione quadrupolare e l’anisotropia del chemical shift.   Le interazioni interessanti che ci forniscono informazioni sulla struttura chimica allo stato solido diventano anisotrope, ovvero dipendono dall’orientazione e subiscono variazioni dipendenti dagli angoli relativi al posizionamento della specie in esame rispetto al campo magnetico esterno applicato. In un liquido i rapidi e casuali moti molecolari rendono il mezzo isotropo e mediano l’anisotropia delle interazioni, mentre in fase liquida l’interazione dipolare ha un valore medio isotropo nullo, per cui non si osserva. In un solido l’assenza di moti isotropi fa sì che lo spettro NMR dipenda dalle diverse orientazioni delle molecole rispetto al campo e dalla loro distribuzione, come la frequenza di risonanza di un dato nucleo dipende dall’orientazione, rispetto al campo, della molecola che lo contiene.  Poiché in un solido tutte le direzioni sono contemporaneamente possibili, uno stesso nucleo potrà risuonare a chemical shift differenti, dipendenti dall’orientazione della molecola rispetto al campo; se, infatti, l’anisotropia del chemical shift in soluzione viene mediata dai moti ad un valore isotropo, questo non avviene nel solido, dove da origine ad una grandezza tensoriale caratterizzata da tre valori, corrispondenti alle tre direzioni ortogonali nello spazio.

probe per HR-MAS-NMR

probe per HR-MAS-NMR

Dato che le interazioni studiate con la NMR hanno una forte dipendenza angolare e la somma di tutti i contributi forniti creerebbe un sistema estremamente complesso da interpretare, è necessario adottare un sistema che permetta di identificare un solo contributo significativo su cui basare lo spettro della specie chimica in questione.  Questo è possibile, appunto, grazie alla rotazione ad angolo magico, che annulla l’effetto delle anisotropie delle diverse interazioni: facendo “spinnare” il campione con un angolo di 54,7° rispetto al campo magnetico applicato, è possibile mediare le disomogeneità del campo stesso e rimuovere gli effetti secondari sopracitati.   Ma attenzione, ciò avviene solo se la frequenza di rotazione è considerevolmente maggiore della frequenza in condizioni anisotrope; a frequenze inferiori si osservano bande rotazionali (spinning side-bands), distanziate di intervalli multipli della frequenza di rotazione.
Fra i possibili utilizzi di questa tecnica riscuote un discreto successo lo studio dei polimeri i quali, però, avendo una struttura piuttosto rigida, non possono essere analizzati tal quali, ma devono essere dispersi in una piccola quantità di un opportuno solvente, ottenendo così un sistema che rispecchi un regime semi-solido.  L’osservazione della formazione di legami e cross-linkings nella produzione di polimeri o di materiali da essi costituiti può essere monitorata efficientemente grazie a questa tecnica: corretta conformazione e porosità delle fasi stazionarie usate in analitica, processo di vulcanizzazione della gomma e trattamento di polietilenglicole sono solo alcuni tra gli esempi di applicazione alla scienza dei materiali.

metabolomica via NMR su cellule di linfoma

metabolomica via NMR su cellule di linfoma

Nel corso degli anni anche i biologi si sono affidati a questa metodica e, al momento, sono numerosissimi gli studi in tal campo che fanno capo al suo utilizzo, grazie al fatto che è possibile studiare l’organo intatto in cui si intende ricercare il metabolita o la classe di molecole di interesse invece di procedere all’estrazione dall’organo stesso, rischiando di perderne una notevole quantità e di non arrivare ad una resa significativa.   Acquisire dati direttamente dal tessuto tal quale assicura che non vi sia una perdita di prodotto, ma nemmeno una sua alterazione nel processo di estrazione.   L’analisi diretta di tessuti utilizzando la tecnica NMR classica è limitata a causa delle risonanze esterne dovute all’irregolarità della forma nel campione e alle disomogeneità nel tessuto.   L’HR-MAS è stata utilizzata per studiare diversi tipi di tessuti, tra cui fegato, cervello, prostata e tessuti tumorali; i tessuti, una volta eliminati gli elementi superflui, vengono alloggiati all’interno di un rotore con una piccola quantità di D2O (acqua deuterata, in cui l’atomo di idrogeno è stato sostituito con l’isotopo deuterio) contenente una sostanza con chemical shift noto.   In questo modo è possibile, oltre a studiare i metaboliti, discriminare tra un tessuto sano e uno malato, anche in casi in cui l’esame istologico non dia risultati accurati.   Nonostante questo tipo di tecnica dia luogo a spettri di una qualità notevole rispetto a quelli ottenibili con la tecnica convenzionale, per le ragioni citate poc’anzi sulla frequenza di rotazione e, in alcuni casi, legate alla natura del materiale in oggetto, la risoluzione non sempre è delle migliori.

 

Studi di interazione in risonanza magnetica

Ad un livello più microscopico ma altrettanto interessante è lo studio delle interazioni tramite NMR: parliamo delle interazioni ligando-proteina, ad esempio, che ci permettono di capire la modalità con cui una data molecola, di qualsiasi natura essa sia, interagisce con una struttura proteica, come un enzima.   Quali siti vengono coinvolti?   Che tipo di legami si instaurano tra le due specie?   Questo tipo di studi riveste una notevole importanza in ambito biomedico tanto quanto in altri campi disciplinari.  Quando due sostanze interagiscono influenzano notevolmente il proprio intorno chimico e questa influenza porta a cambiamenti nell’assetto e nella distribuzione della nube elettronica che possono essere rilevati dalla RM.

interazione ligando-recettore

interazione ligando-recettore

In cosa consiste l’interazione proteina-ligando e perché è così importante?   Questa accoppiata può essere costituita da diverse combinazioni come enzima-substrato, enzima-DNA, proteina-DNA e tante altre; lo studio dell’interazione di queste due specie può essere molto utile, ad esempio, per individuare siti di legame e trarre informazioni preziose per il design razionale di farmaci o per studiare il riconoscimento proteina-ligando a livello atomico.  Inoltre, è utile per compiere studi di “screening” selezionando tra una larga libreria di composti quelle sostanze che mostrino una ottimale capacità di legame con il sito in questione.   Il tutto è possibile grazie all’osservazione di alcuni parametri che possano mostrare un’apprezzabile cambiamento in seguito al verificarsi di un’interazione come lo spostamento chimico e l’intensità del segnale, nonché i tempi di rilassamento dei nuclei.
Le modalità operative sono tante.   E’ possibile utilizzare metodi che permettano di separare i segnali del ligando da quelli della proteina, con la possibilità di analizzare allo stesso tempo i siti di legame della proteina e le regioni del ligando che interagiscono con la proteina, nonché la conformazione strutturale di entrambi.   Inoltre, marcando la proteina con atomi 13C e 15N è possibile selezionare i segnali in funzione del tipo di nucleo cui sono legati i protoni eccitati, con l’opportunità, oltre a ciò, di studiare il sistema in 2 dimensioni per collegare tra loro i segnali relativi ai vari nuclei e capire “chi è legato a cosa”.
HNMR + HR-MASLa spettroscopia bidimensionale 2D-NMR, detta in gergo NMR-COSY, è una delle principali tecniche di risonanza magnetica nucleare che permettono indagini strutturali delle molecole e che si basano sull’accoppiamento del normale spettro NMR con un altro relativo ad un’altra radiazione in modo da ottenere uno spettro in 2 dimensioni.  Il termine bidimensionale indica che le due frequenze di radiazione presentano due diverse scale dei tempi indipendenti.  Lo spettro ottenuto è rappresentato in tre dimensioni, dove sugli assi x e y sono riportati due spettri NMR relativi ad analisi su uno stesso campione.  Si tratta di una tecnica molto utilizzata, soprattutto quando l’interpretazione del normale spettro NMR non è semplice o ci si trova davanti ad una sostanza ignota di cui non si conosce minimamente la struttura.

 

Alimenti e qualità: tutto sotto controllo?

E se in ambito biomedico le applicazioni sono sempre in crescita, anche il campo agro-alimentare trae non pochi benefici dall’uso della spettroscopia NMR.  L’importanza del controllo di qualità sui cibi e, in particolar modo, delle sofisticazioni e contraffazioni sta crescendo sempre di più, anche tenendo conto del fatto che la filiera produttiva è sempre più estesa e spesso fa capo a fornitori di aree geografiche diverse, con legislazioni differenti e con una relativa difficoltà nella reale tracciabilità delle materie prime. Vino e latte, solo per citarne alcuni, sono tra gli alimenti più soggetti a questo tipo di problematiche, e le tecniche di indagine si stanno affinando sempre di più in questo campo.  Garantire la qualità di un prodotto del settore agroalimentare con degustazioni e valutazioni empiriche non è più possibile, la necessità impellente è quella di determinare con assoluta obiettività e certezza la composizione molecolare dei prodotti.  Il consumatore deve essere messo nelle condizioni di effettuare scelte consapevoli avendo a disposizione valori derivanti da analisi rigorose degli alimenti.  In campo alimentare la spettroscopia NMR è utilizzata per valutare sia la qualità dei prodotti di origine controllata sia le frodi e le sofisticazioni.  Anche in questo caso lo sviluppo dell’HR-MAS risulta alquanto prezioso, consentendo di rilevare dettagli importantissimi ai fini della qualità come, ad esempio, la percentuale di latte di bufala in una mozzarella d.o.p.   Anche l’olio d’oliva, uno degli alimenti simbolo della nostra dieta, spesso soggetto a frodi, rappresenta una perfetta matrice su cui eseguire analisi con questa tecnica, permettendo di ricavarne l’origine e l’eventuale presenza di altri oli diversa natura aggiunti.
Ma non ci fermiamo qui; moltissime sono le applicazioni possibili per l’analisi di caffè, tè, carni, fino ai succhi di frutta e gli aromi naturali.
Proprio a proposito della contraffazione è molto interessante notare come anche il questo caso lo studio della metabolomica giochi un ruolo determinante.  La possibilità di individuare metaboliti e creare un imprinting molecolare che rimandi direttamente ad una varietà alimentare, consentendo allo stesso tempo di rilevare differenze nella composizione in modo veloce è un valore aggiunto che questa tecnica ci fornisce.  Grazie all’NMR ad alta risoluzione siamo in grado di rilevare i segnali relativi ai nuclei di H di metaboliti in alimenti, che vengono poi elaborati e semplificati grazie a metodi chemiometrici.  In particolare, la possibilità di sottoporre un singolo campione ad una serie di esperimenti diversi, ci consente di ottenere informazioni diverse e complementari tra loro.  Molto importante questo discorso per quanto riguarda lo studio del latte e dei suoi derivati, possibile da eseguire sia allo stato liquido che allo stato semisolido.  In quest’ultimo caso, in particolare, si utilizza l’HR-MAS, una delle migliori soluzioni per l’analisi di latticini in quanto consente di evitare il trattamento preliminare e di osservare allo stesso tempo le componenti idrofobiche e idrofile, riducendo notevolmente il tempo d’analisi di ciascun campione.  Dato il notevole affollamento di segnali dovuti alle classi di composti rilevate, è necessario poi ricorrere all’analisi statistica per “ordinare” e alleggerire lo spettro in modo che risulti facilmente interpretabile.

NMR vino

spettro NMR ad alto campo del vino

L’alimentazione nel nostro paese può definirsi uno dei vanti maggiori, i prodotti di tutta la penisola vengono invidiati e imitati in tutto il resto del mondo. Olio, vino, pasta in cima al podio si aggiudicano il titolo di alimenti tipici, con denominazioni di origine controllata e una serie di antiche tradizioni alle spalle.
Come abbiamo detto per i formaggi, anche il vino ha la sua nicchia di caratteristiche peculiari che lo rendono unico e prezioso.  Basti pensare ai tentativi di sofisticazione e imitazione di cui continuamente si sente parlare e che lo rendono una vera “specie protetta”!  Il vino come la maggior parte delle sostanze alimentari è una miscela complessa di decine di composti chimici diversi.   Se si mescolano insieme due vini si ottiene una miscela la cui complessità è simile a quella dei vini d’origine.  Per tale motivo determinare la percentuale di ciascun vino presente nella miscela è un problema analitico molto più complesso che l’identificazione dei singoli composti presenti. Inoltre, per poter identificare un sistema complesso, quale un vino, all’interno di un sistema altrettanto complesso quale una miscela di vini, è necessaria una conoscenza sufficientemente dettagliata di ciascuno dei costituenti. La risonanza magnetica nucleare ci permette una caratterizzazione di sistemi complessi quali le sostanze alimentari poiché è possibile determinare simultaneamente un numero elevato di composti.  Poiché il profilo metabolico di un vino ha una variabilità naturale legata alle materie prime e ai metodi di produzione, il riconoscimento del profilo NMR di ciascun vino all’interno della miscela richiede l’utilizzo di tecniche statistiche avanzate.
formaggio e acetoMa non è tutto.  Anche l’aceto balsamico, altro vanto della nostra tradizione culinaria, nella sua versione originale e tradizionale non conosce pari.  E’ notoriamente un prodotto molto antico proveniente esclusivamente dalla zona di Modena e Reggio Emilia con metodi di preparazione del tutto particolari tramandati di generazione in generazione, ottenuto dalla fermentazione alcolica ed acetica del mosto cotto e concentrato mediante una prima fase di maturazione ed un lento invecchiamento in botti di legno per diversi anni, spesso e volentieri anche fino a 25 anni.  Non è difficile immaginare come la ridotta accessibilità ad un prodotto di questo genere, per i costi e per il lungo tempo necessario alla sua produzione, abbia dato adito, esattamente come nel caso del vino, alla produzione di una tipologia di aceto balsamico molto “semplificato”.  L’aceto balsamico di Modena, senza denominazioni particolari, è infatti un prodotto ottenuto industrialmente da mosto cotto cui viene addizionato aceto di vino e un colorante, il caramello E150, per conferire la colorazione scura tipica. In questo caso la maturazione in botte varia dai 60 giorni ad un massimo di tre anni per il prodotto definito invecchiato.  E’ assolutamente d’obbligo, quindi, ai fini di garantire una corretta denominazione di origine protetta e alta qualità al consumatore, eseguire un controllo che permetta di discriminare tra le varie tipologie di aceto.  Anche un consumatore non attento si accorgerà della lampante differenza tra l’aceto comprato sullo scaffale del supermercato ad un prezzo basso e quello reperibile in un’acetaia, ma è di gran lunga più difficile accorgersi di una sofisticazione o stabilire l’età di un aceto balsamico solo guardandolo.  Ma anche in questo caso le tecniche analitiche hanno fatto passi da gigante e la risonanza magnetica ci regala ancora una volta grosse soddisfazioni.  Nel caso dell’aceto balsamico, ad esempio, accoppiando la gas-cromatografia all’NMR otteniamo uno spettro di informazioni davvero ampio.  L’analisi GC, infatti, permette di quantificare molti componenti come zuccheri, acidi organici, amminoacidi e, soprattutto, aromi, costituenti fondamentali per questo tipo di prodotto.  D’altro canto, dallo spettro NMR rileviamo l’impronta digitale del prodotto, che permette di ottenere un gran numero di informazioni in una sola analisi e consente la discriminazione degli aceti balsamici commerciali da quelli tradizionali, tra aceti balsamici tradizionali prodotti in diverse acetaie e infine tra aceti balsamici tradizionali a diverso grado di invecchiamento.  Non male, no?

In definitiva, se pensiamo a tutte le applicazioni descritte finora, che coprono campi disciplinari molto distanti tra loro e se pensiamo, soprattutto, a tutto quello che ancora aspetta di essere scoperto, possiamo affermare molto sicuramente che la risonanza magnetica nucleare è stata e continuerà ad essere un’ottima e insostituibile risorsa tecnologica.

 

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