Come un metallo rivoluzionò la medicina: breve storia del cis-platino

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di Giuseppe Alonci

Questo articolo è il secondo della serie dedicata agli effetti biologici dei metalli pesanti.  Nello scorso articolo (I metalli, la medicina e la salute: un rapporto complesso) avevamo introdotto alcuni dei concetti base che incontreremo via via in questo e nei prossimi lavori e avevamo visto, prendendo il mercurio come esempio, quanto può essere difficile e complesso delineare un limite tra buono e cattivo, sicuro e non sicuro.  Lo stesso problema lo incontreremo anche con i farmaci a base di platino, che sono l’oggetto di questo scritto, nei quali il miglioramento del rapporto tra danno e beneficio è continuo oggetto di studio e di ricerca.

 

Un metallo veramente prezioso

Quando pensiamo al platino pensiamo al denaro. Non è una novità, al sentire nominare questo elemento il pensiero di chi non è un chimico (o un oncologo) corre immediatamente a gioielli estremamente costosi, a carte di credito platinum, tessere fedeltà platinum e in generale a tutto ciò che è particolarmente costoso ed esclusivo.

cristalli di platino

Fig. 1 – cristalli di platino

In realtà il platino è ben più di un vezzo inutile o di un simbolo di ricchezza: esso infatti entra nelle nostre vite attraverso un ampio spettro di applicazioni. La maggior parte di noi si porta dietro, ogni giorno, dagli uno ai tre grammi di questo metallo, dato che costituisce il cuore delle nostre marmitte catalitiche, che ci permettono di rendere ecologicamente più sostenibili i (troppo) frequenti spostamenti su strada a cui siamo abituati. Per le sue proprietà catalitiche è anche utilizzato nell’industria petrolifera, nell’industria farmaceutica e nell’industria alimentare (ad esempio per l’idrogenazione degli olii vegetali a margarina), mentre per la sua tipica inerzia chimica è utilizzato negli elettrodi e, in lega con l’iridio, costituisce il “chilogrammo standard”, conservato presso l’Ufficio Internazionale dei Pesi e delle Misure a Sèvres, in Francia [1].
In questo articolo ci concentreremo principalmente sul suo uso come chemioterapico, sotto forma di cis-platino. Gli effetti antitumorali di questa molecola furono scoperti da Barnett Rosenberg [2], un fisico della Michigan State University, nel 1965. Il cisplatino si è rivelato particolarmente efficace nella lotta di molti tipi di tumori, dal carcinoma del polmone ai tumori ai testicoli e alle ovaie. Oggi è uno dei tre antitumorali più venduti con un fatturato che, nel 1996, era già di quasi cinquecento milioni di dollari [3]. Grazie all’utilizzo di questa molecola, in combinazione con altri antitumorali, la sopravvivenza al cancro testicolare è passata dal 10 all’85%! [4]
Purtroppo sin da subito ha mostrato anche dei pesanti effetti collaterali, in particolare nei confronti dei reni. Nonostante tutto è ancora oggi uno dei farmaci antineoplastici più utilizzati, grazie anche all’utilizzo di agenti protettori che ne mitigano la tossicità.
Serendipità

ritratto di Barnett Rosenberg

Fig. 2 – Barnett Rosenberg

Barnett Rosenberg (New York, 16 novembre 1926 – Lansing, 8 agosto 2009) e i suoi collaboratori stavano studiando l’effetto delle correnti elettriche sulla replicazione di un batterio, Escherichia coli. Tutto iniziò nel 1961 quando Rosenberg, che lavorava come fisico alla New York University, fu assunto per lavorare nel nascente dipartimento di biofisica dell’Università del Michigan. Egli era particolarmente attratto da uno strano parallelismo tra due fenomeni naturali completamente slegati: si era infatti accorto che le fotografie delle cellule impegnate nella fase di mitosi, cioè di divisione cellulare, erano molto simili alle immagini delle linee di campo prodotte da un magnete su una superficie ricoperta di finissima limatura di ferro, analoghe alle linee di campo di un dipolo elettrico. Questa somiglianza sembrava essere degna di ulteriori investigazioni e così decise di studiare in che modo un campo elettrico influenza la replicazione cellulare. Ovviamente per un fisico occuparsi di cellule, batteri e colture cellulari era tutt’altro che immediato, e Rosenberg decise saggiamente di assumere una giovane microbiologa per aiutarlo, Loretta Van Camp [5]. Quest’ultima sognava una carriera legata alla medicina, ma dato che per una donna statunitense degli anni ’60 diventare medico era quasi scandaloso, decise di ripiegare sulla microbiologia. Nel laboratorio di Rosenberg lei si occupò di tutto il setup sperimentale. Sebbene fosse il fisico a elaborare concettualmente gli esperimenti, Van Camp con la sua esperienza permise di mettere effettivamente alla prova le idee di Rosenberg.
Prima di iniziare gli esperimenti su cellule eucariote i due scienziati decisero di fare dei test di prova su un organismo più semplice, come l’E. coli, un batterio utilizzatissimo ancora oggi nella ricerca biologica.
L’attrezzatura utilizzata consisteva di un reattore dotato di due elettrodi semicilindrici costituiti da una rete di platino immersi in un brodo di coltura, mantenuto alla temperatura di 37°C e contenente importanti quantità di ioni cloruro e di glucosio. Nel sistema veniva inoltre insufflata aria sterile dall’esterno. La scelta di utilizzare un elettrodo di platino sembrava effettivamente la più logica e sensata. Come tutti i metalli nobili, il platino è estremamente inerte dal punto di vista chimico e per corroderlo sono necessarie condizioni di reazioni molto drastiche e sicuramente ben peggiori di un brodo di coltura appena tiepido. Qualunque studente che abbia studiato un po’ di elettrochimica sa che gli elettrodi al platino sono ancora oggi onnipresenti nei laboratori di tutto il mondo, proprio perché sono (dovrebbero essere?) garanzia di inerzia.

dalla pubblicazione originale di Rosenberg: individui di E. coli normali (a) e allungati in modo anomalo (b) in seguito all'esposizione ad una soluzione contenente pochi mg/l di cis-diamminodicloroplatino (II)

dalla pubblicazione originale di Rosenberg: individui di E. coli normali (a) e allungati in modo anomalo (b) in seguito all’esposizione ad una soluzione contenente pochi mg/l di cis-diamminodicloroplatino (II)

Il risultato di questi test preliminari fu tuttavia completamente inaspettato. I batteri infatti non erano morti, né erano aumentati di numero: si erano allungati! Normalmente gli E. coli hanno la forma di piccoli bastoncelli, ma dopo il trattamento al quale erano stati sottoposti avevano assunto la forma di spaghetti. Sembrava quindi che qualcosa aveva impedito loro di replicarsi, promuovendo una abnorme crescita in lunghezza. Un fenomeno simile era decisamente stravagante e meritava ulteriori approfondimenti. I due scienziati iniziarono quindi a cambiare uno per volta tutti i parametri dell’esperimento. Per prima cosa iniziarono a cambiare la frequenza della corrente impiegata, provando a variarla dai 500 fino ai 106 Hertz. L’uso della corrente alternata era necessario per evitare fenomeni di elettrolisi o di polarizzazione degli elettrodi. Il massimo della crescita si ebbe a 500 Hz mentre aumentando la frequenza fino ai 6000 Hz il fenomeno diventava sempre meno importante, fino a diventare trascurabile a frequenze superiori. Anche la presenza dell’ossigeno era fondamentale: lavorando in ambiente anaerobio con azoto o elio non si osservava infatti niente di particolare. Tanti altri fattori che potevano interferire con la crescita dei batteri, quali il pH, la concentrazione di magnesio, i raggi UV e la temperatura, furono studiati ma non si rivelarono importanti: la risposta doveva stare in qualche tipo di composto che si formava in seguito al passaggio di corrente.
Per verificare quest’ipotesi decisero di ricorrere ad un espediente molto semplice: sottoposero il brodo di coltura, senza i batteri, alle condizioni nelle quali si era osservato l’allungamento delle cellule. I batteri furono inoculati solo successivamente all’interruzione del passaggio di corrente. L’esperimento confermò che non era quindi la corrente elettrica ad essere responsabile dei fenomeni osservati. Fu allora richiesto al giovane chimico Thomas Krigas di unirsi al gruppo per investigare sull’identità della molecole presenti nel medium di coltura e sulle proprietà biologiche di questi composti. I risultati mostrarono che ad essere attivi erano molti complessi dei metalli dei gruppi 8, 9 e 10, ma che quelle con la maggiore attività erano derivati del platino.
Il 13 febbraio 1965, sulla prestigiosa rivista “Nature”, viene pubblicato così un articolo a firma di Barnett Rosenberg, Loretta Van Camp e Thomas Krigas su queste loro scoperte, che segnerà l’inizio di un percorso che porterà a rivoluzionare per sempre la storia della medicina. [6]
Successivamente vennero condotti test con molte molecole diverse. Dopo aver osservato che queste bloccavano la replicazione cellulare ma erano sostanzialmente innocue per la vita dei batteri, il passo successivo fu quindi di verificare se lo stesso poteva dirsi per le cellule dei mammiferi e se potevano anche bloccare la crescita dei tumori. Per questo motivo furono studiati due modelli murini di tumori, il Sarcoma 180 e la Leucemia L1210 [7] [8]. Gli studi in vivo mostrarono che tra tutti i complessi del platino proposti, il più efficace ed il meno tossico era il cisplatino, Pt(NH3)2Cl2.

Michele Peyrone e il Verde di Magnus, una sostanza che ha rivestito interesse nella fisica dello stato solido per la sua "monodimensionalità"

Michele Peyrone e il Verde di Magnus, una sostanza che ha rivestito interesse nella fisica dello stato solido per la sua “monodimensionalità”

Questa molecola, la cui struttura è riportata in Figura 3 Struttura del cis- e del trans-platino era in realtà già nota da tempo con il nome di “Sale di Peyrone”, per essere stata sintetizzata già nel 1844 [9] [10] dal chimico italiano Michele Peyrone (1813–1883), ma nessuno ne aveva mai intuito il nascosto potenziale. Michele Peyrone [11] nacque il 26 maggio 1813 a Mondovì, nei pressi di Torino. Iniziò la sua carriera scientifica come medico, ma dopo qualche anno decise di dedicarsi interamente alla chimica, trasferendosi prima nel 1839 a Parigi, nel laboratorio di Jean Baptiste André Dumas, e successivamente, nel 1842, nel laboratorio di Justus von Liebig a Gießen. Qui incominciò a studiare le proprietà dei sali del platino, in particolare di quello che era chiamato “Verde di Magnus”, [Pt(NH3)4][PtCl4], dal nome della prima persona che lo sintetizzò nel 1828, Heinrich Gustav Magnus. Durante un tentativo di sintesi di questa molecola, Peyrone notò la precipitazione di un sale diverso da quello aspettato, non solo per il colore giallo ma anche per le proprietà chimiche molto differenti da quelle aspettate. Al tempo però l’esatta struttura e geometria della molecola era sostanzialmente incognita.
A fare luce su questi aspetti fu Alfred Werner (1866-1919), che “In riconoscimento del suo lavoro sul legame degli atomi nelle molecole per mezzo del quale ha gettato nuova luce sulle ricerche precedenti e aperto nuovi campi di ricerca specialmente in chimica inorganica” vinse il premio Nobel per la chimica nel 1913. L’eredità che Werner ha lasciato alla chimica inorganica è enorme e meriterebbe un articolo tutto per sé. Per avere un’idea si può leggere qui: http://www.technology.matthey.com/article/41/1/34-40/.

struttura del cis- e trans-diamminodicloroplatino (II)

Fig. 3 – struttura del cis- e trans-diamminodicloroplatino (II)

Oggi sappiamo che il cisplatino è una molecola costituita da un atomo di platino con stato d’ossidazione +2 a cui sono legati due ioni cloruro e due molecole di ammoniaca. Ha una geometria quadrato-planare, come tutti i complessi di platino (II): planare perché tutti gli atomi sono disposti su uno stesso piano e quadrata perché tutti i legami sono uguali e formano un angolo di 90° con il platino centrale. Una piccola parentesi va aperta sul significato del prefisso “cis”. In Figura 3 sono mostrate le formule di struttura di due molecole molto simili, il cis-platino e il trans-platino. Queste due molecole sono isomeri geometrici, perché sono costituite dagli stessi atomi, legati tra loro allo stesso modo, ma che differiscono per come questi atomi sono disposti nello spazio. L’isomero cis contiene le due molecole di ammoniaca dalla stessa parte, mentre nell’isomero trans sono da parti opposte. La differenza di reattività chimica tra queste due specie è sorprendente, infatti mentre l’isomero cis ha una forte attività antitumorale, la forma trans è molto meno efficace. Anche la reattività chimica è leggermente diversa, con la forma cis decisamente più inerte rispetto quella trans.

 

Meccanismo di azione del cis-platino

L’efficacia del cisplatino (Cis-Pt) è legata alle sue capacità di interagire con il DNA contenuto all’interno del nucleo cellulare inducendo l’apoptosi, cioè la morte programmata della cellula. L’apoptosi si verifica quando la cellula arriva alla fine naturale del suo ciclo vitale o quando è danneggiata irreversibilmente. Se per qualche motivo si degrada la capacità apoptotica di una cellula, questa può potenzialmente diventare una cellula tumorale, iniziando a riprodursi illimitatamente. Questa degradazione può avere diverse origini: può essere dovuta alla presenza di sostanze tossiche nell’organismo, alle radiazioni o alla presenza di alcuni virus (come il virus HPV, Human Papilloma Virus).
Il cisplatino deve essere somministrato per via intravenosa, attraverso una flebo di soluzione salina sterile contenente 1 mg/ml di farmaco, 9 mg/ml di cloruro di sodio e dell’acido cloridrico/idrossido di sodio per portare il pH a circa 4. La somministrazione deve essere effettuata molto lentamente e a causa dei suo gravi effetti nefrotossici è necessario inoltre che il paziente sia continuamente idratato. È infatti raccomandato che il paziente siano infusi almeno 1-2 litri di fluidi nelle ore precedenti al trattamento. Il farmaco viene inoltre diluito in circa 2 litri di soluzione fisiologica contente destrosio e mannitolo. [12]
Una volta che entra nel circolo sanguigno, il cisplatino inizia a interagire in maniera complessa con molte delle molecole naturalmente presenti nel sangue, come gli zuccheri, proteine e lipidi. Particolarmente rilevante è la sua interazione con proteine contenenti zolfo, che come visto nella nostra precedente introduzione (I metalli, la medicina e la salute: un rapporto complesso) è molto affine ai metalli pesanti, proprio come il platino.
Altrettanto importanti sono anche gli equilibri in cui il platino è coinvolto in soluzione acquosa, mostrati in Figura 4.

meccanismo di azione del cisplatino

Fig. 5 – meccanismo di azione del cisplatino

All’interno della cellula la concentrazione di ione cloruro è molto minore rispetto all’ambiente extracellulare, permettendo così all’equilibrio di Figura 4 di spostarsi verso destra, verso cioè le forma idrolizzata. Sarà poi la forma idrolizzata ad attraversare la membrana nucleare per legarsi al DNA (Figura 5).
Il DNA è costituito tre elementi fondamentali: nucleotidi (adenina, timina, citosina e guanina), zucchero (in particolare il deossiribosio) e gruppi fosfato. La catena zucchero-fosfato costituisce lo scheletro esterno della doppia elica, mentre i nucleotidi (o basi azotate) sono proiettati all’interno della doppia elica e costituiscono la parte codificante (cioè che trasmette informazioni) del DNA (per approfondire: “Struttura degli acidi nucleici varianti“).

legame tra guanina e cisplatino

Fig. 6 – legame tra guanina e cisplatino

Il Cis-Pt agisce andando a legarsi proprio ad una di queste basi azotate, la guanina (G), come mostrato in Figura 6.
Nonostante la straordinaria affinità per lo zolfo, il legame più stabile dal punto di vista termodinamico è infatti quello tra platino e azoto. L’addotto iniziale è formato tra una molecola di guanina e una molecola di cisplatino monoidrolizzata. È interessante notare che, dei cinque azoti presenti sulla guanina, uno solo può legarsi al farmaco, quello in posizione N(7).

interazione tra guanina e citosina

Fig. 7 – interazione tra guanina e citosina

Come si vede chiaramente dalla Figura 7, l’azoto N(9) è infatti impegnato nel legame covalente con lo scheletro di zucchero-fosfato del DNA, mentre l’azoto in posizione N(1) e quello legato al C(2) sono impegnati a formare dei legami idrogeno con la citosina, la base coniugata della guanina. L’azoto N(3) si trova invece in una posizione poco accessibile, essendo “nascosto” all’interno della doppia elica. Gli addotti che possono formarsi dopo l’unione del cis-Pt con l’N(7) di una guanina, possono essere di vario tipo. In generale coinvolgono un secondo atomo donatore, che può legarsi tramite una diretta sostituzione del cloruro o tramite una prima sostituzione del cloruro da parte dell’acqua e quindi un successivo spostamento dell’acqua da parte del nucleofilo. A seconda della provenienza del secondo atomo donatore, possiamo avere diverse possibilità (vedi Figura 5):
– Legame con una proteina, in particolare quelle ricche di amminoacidi solforati;
– Legame intercatena (cioè tra due filamenti diversi) con un’altra guanina;
– Legame intracatena (cioè all’interno dello stesso filamento) tra due G adiacenti (~ 65%);
– Legame intracatena da due G separate da un terzo nucleotide;
– Legame intracatena tra una G ed una adenina (~25%).

distorsione della geometria del DNA per interazione con il cisplatino

Fig. 8 – distorsione della geometria del DNA per interazione con il cisplatino

Questi legami provocano delle importanti distorsioni nella geometria del DNA, piegano la doppia elica anche di 40°, inibendone così la replicazione e la trascrizione (Figura 8).
Durante la duplicazione del DNA è infatti necessario che i due filamenti si separino tra di loro, in modo poi che ognuno di essi possa fungere da “stampo” per la sintesi di una nuova doppia elica. Questa separazione avviene grazie a particolari enzimi, chiamati DNA polimerasi, che aprono in due la doppia elica un po’ come se fosse una cerniera. Bloccando questa fase di apertura la replicazione del DNA è impedita e quindi anche la mitosi cellulare, cioè il processo con il quale si moltiplicano le cellule, è impedita. Dato che le cellule tumorali hanno la caratteristica di riprodursi molto più velocemente rispetto a quelle sane è evidente che risentono molto di più della presenza del cis-Pt rispetto quelle sane. Allo stesso modo anche la trascrizione è bloccata. La trascrizione è il processo con il quale le informazioni genetiche, contenute nel DNA, vengono passate ad un filamento complementare di RNA, che poi permetterà nella fase di traduzione la sintesi delle proteine. Bloccare la trascrizione vuole dire quindi bloccare anche la sintesi di proteine da parte della cellula, proteine che possono essere fondamentali per il suo corretto funzionamento.
Una volta che il platino si è legato al DNA il fato delle cellule non è però ancora segnato. Le possibilità infatti sono due: o il danno del DNA è tale da portare la cellula all’apoptosi oppure può essere riparato (come vedremo successivamente). Questo è un punto importante da sottolineare: la morte della cellula non è dovuta direttamente all’impossibilità della replicazione o della trascrizione, ma all’inizio del meccanismo di apoptosi dopo che il danno è stato rilevato dai meccanismi di controllo della cellula.

 

La resistenza al ciplatino [15] [16]

Nonostante il cisplatino abbia salvato una quantità incommensurabile di vite, purtroppo non è sempre efficace. Alcune cellule sono in effetti già intrinsecamente resistenti al suo effetto, mentre altre lo diventano man mano che la terapia procede. I meccanismi tramite i quali viene esercitata questa resistenza sono molteplici e non completamente chiariti. Come abbiamo visto prima, l’azione del cis-Pt coinvolge molti processi che, se in qualche modo turbati, possono portare allo sviluppo di una resistenza.
Innanzi tutto può diminuire la concentrazione di platino disponibile all’interno della cellula, sia a causa di un aumentato efflusso extracellulare sia per un problema in fase di attraversamento della membrana. Le proteine ATP7A/B, di cui abbiamo parlato nella sezione precedente, sono infatti sovraespresse in molte linee cellulari resistenti al cis-Pt. Analogamente, molte cellule resistenti mancano della proteina CTR-1, che favorisce l’ingresso del farmaco. Anche le proteine MDR (Multi-drug resistance protein) sembrano essere coinvolte nel meccanismo di efflusso del platino dall’ambiente cellulare.
Anche la formazione di addotti con le metallotioneine e con il glutatione possono essere problematici. Sebbene dal punto di vista termodinamico il legame Pt-N sia più forte di quello Pt-S, dal punto di vista cinetico, cioè della velocità di reazione, avviene il contrario. Se la concentrazione intracellulare di queste sostanze aumenta, allora aumenta anche la percentuale di platino non disponibile a legarsi al DNA. Il platino legato al GSH inoltre può essere espulso dalla cellula grazie ad una serie di proteine di membrana, chiamate pompe d’efflusso GS-X. Sono però le metallotioneine quelle che sequestrano la più grande quantità di platino, essendo quasi cinquanta volte più efficaci del glutatione a questo scopo.
Ma anche dopo che il cisplatino si lega al DNA ancora non è detto che riesca a svolgere fino in fondo la sua attività tossica! Il DNA infatti è infatti continuamente “protetto”, tramite una serie di meccanismi capaci di correggere difetti e lesioni. In questa maniera il nostro corredo genetico può resistere ai continui attacchi che subisce (sotto forma di radioattività naturale, sostanze tossiche, ma anche mutazioni e difetti casuali). I due meccanismi di riparazione che sembrano giocare il ruolo più importante per sopperire ai danni prodotti dal cis-Pt sono chiamati NER (riparazione per escissione di nucleotidi) e MMR (DNA mismatch repair).

meccanismo NER (Nucleotide Excision Repair) per la riparazione del DNA

meccanismo NER (Nucleotide Excision Repair) per la riparazione del DNA

La via NER [17], in maniera molto semplificata, consiste nella rimozione del segmento di DNA danneggiato e nella sua sostituzione. Il danno può essere rilevato o in fase di trascrizione (TC-NER, transcription coupled-nucleotide excision repair) oppure può esserne indipendente (GG-NER, global genomic-nucleotide excisionrepair). Nel primo caso il danno viene riconosciuto quando la RNA polimerasi, il complesso proteico responsabile dello “srotolamento” del DNA che porterà poi alla formazione del filamento complementare di RNA, incontra un blocco causato da un danno. Questo blocco è il segnale per l’intervento di un complesso formato da più di venti proteine, chiamato riparosoma, che rimuove il tratto lesionato, che verrà poi sostituito. Nel secondo caso il danno viene invece rilevato da particolari proteine, come la DBB, che scansionano continuamente il DNA alla ricerca di danni. Una delle proteine chiave coinvolte nel meccanismo NER è la ERCC1, che sembra giocare un ruolo fondamentale nella resistenza al cis-Pt. Cellule in cui questa proteina è sottoespressa sembrano essere particolarmente sensibili al ciplatino, sebbene in altre linee cellulari anche una sovraespressione della proteina porti ad un’aumentata citotossicità del farmaco. Un altro meccanismo con cui la NER conferisce resistenza al cisplatino sembra riguardare la proteina XPA, che è sovraespressa nelle cellule resistenti e poco presente in alcune linee cellulari di cancro ai testicoli particolarmente sensibili al platino.
La via MMR serve a correggere i normali errori di replicazione che possono avvenire durante il processo di divisione cellulare. Come detto precedentemente, il processo di replicazione consiste in una iniziale apertura “a cerniera” del DNA, i cui due filamenti una volta separati funzionano da “stampo”. Durante questa seconda fase può succedere che un nucleotide appartenente al filamento originale si accoppi con il nucleotide sbagliato. Questo tipo di errore è chiamato “mismatch” e viene corretto grazie all’intervento di una serie di proteine, come hMSH2, hMSH6, hMLH1 e tante altre. Queste proteine agiscono insieme per individuare il sito dell’errore, eliminare il nucleotide sbagliato e, insieme ad altri enzimi come le DNA Polimerasi e le DNA ligasi, sostituirlo con quello giusto. È importante notare che la via MMR non è capace di riparare il DNA danneggiato dal cisplatino. È quindi probabile che sia proprio questo fallimento a portare all’attivazione del segnale di apoptosi, tanto che cellule in cui il complesso MMR è poco presente sono in genere resistenti al cisplatino.
Perché il corredo genetico sia trasmesso correttamente, questi meccanismi dovrebbero correggere il DNA prima della replicazione. Tuttavia in certi casi può succedere che la cellula trovi delle vie per bypassare il danno, riprodursi e apportare quindi le necessarie correzioni successivamente.

raffigurazione della proteina p53 nella sua interazione con la doppia elica del DNA

raffigurazione della proteina p53 nella sua interazione con la doppia elica del DNA

In questi processi un ruolo fondamentale è giocato da una proteina, chiamata p53, implicata nella normale regolazione del ciclo cellulare e che spesso è disattivata nelle cellule tumorali. Se durante la mitosi cellulare vengono rilevati dei danni, questi inducono alcune proteine a fosforilare la p53, che normalmente è in forma inattiva, legata ad una proteina chiamata MDM2. Durante la mitosi, la cellula deve passare attraverso una serie di checkpoints, dei momenti nei quali la replicazione cellulare è momentaneamente bloccata per permettere dei controlli che verifichino la correttezza degli eventi precedenti e correggano gli eventuali errori. Una volta attivata, la p53 dà origine ad una cascata di reazioni, che portano o alla riparazione del danno o alla morte cellulare programmata, sebbene ancora i meccanismi attraverso i quali la p53 riesca a valutare l’estensione del danno e quindi la maggiore o minore probabilità di una riparazione efficace siano ancora poco conosciuti.
L’inizio della fosforilazione della p53 è associata a due enzimi, chiamati ATM e ATR. Il cisplatino attiva preferenzialmente la proteina ATR, che a sua volta attiva poi altri enzimi e complessi enzimatici che andranno ad attivare la p53. In particolare l’attivazione della proteina ATR porta all’attivazione di una classe di proteine chiamate MAPK (Mitogen-activate protein kinase), che includono una proteina chiamata ERK (Extracellular signal-regulated kinase). L’attivazione di ERK sembra essere uno degli eventi fondamentali che portano alla apoptosi indotta dal cisplatino, sebbene gli studi su questo punto siano a volte contrastanti tra di loro.
La resistenza al cisplatino può quindi anche essere associata ad una disfunzione del meccanismo di attivazione della MAPK o della p53.

 

Qualche alternativa

effetti collaterali farmaciIl cisplatino, nonostante i suoi enormi vantaggi, ha anche dei considerevoli effetti collaterali che ne hanno quasi impedito la commercializzazione. Tra questi, i più deleteri sono sicuramente gli effetti nefrotossici e quelli a carico del sistema nervoso, sebbene ormai si riesca a tenerli a bada grazie allo sviluppo di appositi agenti protettori, come la amifostina, e grazie all’utilizzo combinato di cis-Pt e di altri antitumorali. La terapia col cisplatino continua però a essere estremamente scomoda per il paziente, che è costretto a sottostare a lunghissime sedute di chemioterapia che richiedono l’ospedalizzazione e l’assistenza da parte di medici e personale specializzato. Un altro grosso problema è legato alla resistenza, naturale o indotta, di molti tumori verso la terapia e in alcuni casi all’insorgere di tumori secondari. Nonostante quindi il trattamento con cisplatino abbia avuto un fortissimo impatto sulla chemioterapia moderna e sia ancora la base del trattamento di molto tumori solidi, si spera di riuscire a trovare delle nuove molecole che possano avere effetti collaterali nulli o lievi, che non diano problemi di resistenza e che possano essere assunte dal paziente direttamente nella propria abitazione, magari per via orale. Nello sviluppo di nuovi chemioterapici a base di platino è stato fondamentale individuare della relazioni tra la struttura della molecola e la sua attività farmacologica, in modo da poter procedere nella ricerca molto più velocemente e in maniera razionale.
Cleare e Hoeschele, basandosi sui risultati ottenuti testando molti diversi complessi di platino e palladio, nel 1973 enunciarono alcune regole che dovrebbero permettere un design più intelligente dei nuovi farmaci [18]:
– La molecola dovrebbe contenere due gruppi amminici in posizione cis;
– La molecola dovrebbe contenere anche due buoni gruppi uscenti, preferenzialmente in posizione cis. Questa condizione è indispensabile per permettere il legame della molecola con il DNA.

Bisogna però prestare attenzione al fatto che leganti troppo labili portano ad un prodotto estremamente tossico, mentre gruppo troppo fortemente legati portano a complessi inattivi;
– Il composto dovrebbe essere neutro per penetrare al meglio all’interno della membrana cellulare;
– Ogni gruppo amminico dovrebbe contenere almeno un protone;
– Lo stato d’ossidazione del platino può essere sia +2 che +4, ma probabilmente è solo il +2 ad essere poi attivo biologicamente. I complessi di Pt(IV) avrebbero effettivamente molti vantaggi rispetto a quelli di Pt(II), tra tutti la maggiore solubilità in acqua che li renderebbe più facili da somministrare, sebbene siano meno attivi e ancora molto poco studiati.

Le molecole sintetizzate seguendo queste regole hanno però lo svantaggio di essere simili al cisplatino sia dal punto di vista dell’attività farmacologica sia dal punto di vista degli effetti collaterali. Di tutte le migliaia di molecole sintetizzate e testate, solo per cinque (vedi Figura 9) è stato approvato l’uso clinico:

farmaci a base di platino entrati in uso clinico

Fig. 9 – farmaci a base di platino entrati in uso clinico

Carboplatino (1989), Nedaplatino (1996), Oxaliplatino (2002), lobaplatino (2004) e eptaplatino (2005). [19]

Di tutti questi nuovi farmaci, il carboplatino è quello di più largo utilizzo. È stato sintetizzato per la prima volta nel 1973 da Cleare e Hoeschele, che lo riportarono per la prima volta nel loro lavoro sulle relazioni struttura-attività [18], ma l’uso clinico è stato approvato dalla FDA solo nel 1989.
La presenza di un unico anello, che si lega alle due posizioni in cui era legato il cloruro nel cisplatino, porta a dei grandi cambiamenti nella sua reattività, rendendolo molto più inerte. I motivi sono principalmente due: da una parte l’effetto chelato, di cui parleremo a breve, e secondariamente il fatto che la presenza di un ciclo rende il platino più difficilmente accessibile dalle molecole di acqua.
L’effetto chelato è ben noto ai chimici inorganici: sostituire due leganti (come il cloruro) con un’unica molecola “chelante” (cioè che si lega utilizzando non uno, ma due dei suoi atomi, esattamente come farebbe un granchio con le sue chele), porta ad avere complessi molto più stabili. Come abbiamo visto prima, una delle ragioni della grande tossicità del cisplatino era il fatto che veniva quasi immediatamente “sequestrato” da un gran numero di proteine normalmente presenti nel sangue, solo una parte riusciva a entrare nella membrana cellulare. Utilizzando leganti di questo tipo si ritarda il momento in cui i gruppi uscenti sul platino vengono sostituiti dalle molecole di acqua o da altre proteine.

meccanismo di sostituzione di uno ione cloruro con l'acqua nel cisplatino

meccanismo di sostituzione di uno ione cloruro con l’acqua nel cisplatino

Per capire invece in quale modo la geometria stessa del legante rende il centro di platino meno reattivo, dobbiamo dire qualche parola sul meccanismo con il quale avvengono le reazioni di sostituzione sui complessi del platino. Le reazioni che abbiamo visto fin ora, come quelle in cui l’acqua sostituiva lo ione cloruro, sono esempi di reazioni di sostituzione nucleofila. Una rappresentazione abbastanza schematica del procedere della trasformazione è riportata in Figura 10.
I complessi di Pt(II) sono quadrato planari, cioè è come se i quattro sostituenti fossero ai vertici di un quadrato (un parallelogramma in prospettiva) e l’atomo di platino fosse al centro. Quando l’acqua (gruppo entrante), attacca la molecola, può farlo quindi da sopra o da sotto il piano. Questo attacco porta alla formazione di un intermedio a cinque termini, una bipiramide a base trigonale (meccanismo associativo), che poi evolve alla molecola finale perdendo uno ione cloruro (gruppo uscente).

ingombro sterico sul carboplatino

Fig. 11 – ingombro sterico sul carboplatino

Perché sia possibile che avvenga la reazione è quindi necessario che il gruppo entrante trovi lo spazio per attaccare la molecola e che sia possibile avere un cambio di geometria da planare quadrata a bipiramide pentagonale. Una misura di questo spazio disponibile è l’ingombro sterico. Atomi e molecole non sono corpi puntiformi, ma sono circondati da nuvole elettroniche, cioè regioni di spazio in cui è molto probabile trovare degli elettroni. Queste nuvole elettroniche non possono compenetrarsi a vicenda liberamente, quindi se una regione di spazio è occupata dalle nuvole elettroniche degli atomi costituenti un gruppo funzionale, quella regione di spazio sarà difficilmente penetrabile da un’altra molecola.
In Figura 11a è mostrata la struttura tridimensionale del carboplatino. Sebbene le due molecole di ammoniaca e i due atomi di ossigeno si trovino sul piano, il resto della molecola si estende sopra (o sotto il piano). Le molecole però non sono rigide, ma vibrano e cambiano conformazione. L’anello a quattro termini nella realtà è in continuo movimento tra le due posizioni limite rappresentate, occupando così un’importante porzione di spazio. Altrettanto importanti sono poi i due idrogeni rappresentati esplicitamente in figura (ce ne sono altri quattro sottintesi), che come si vede si protendono verso l’interno della molecola impedendo l’attacco da sopra e da sotto. Si tratta quindi di un gruppo molto ingombrante stericamente che così blocca l’accesso alle molecole d’acqua (Figura 11b), rendendo quindi molto più lento il processo di sostituzione.
Questa relativa inerzia chimica doveva rendere, nelle intenzioni, il carboplatino meno tossico rispetto al suo analogo clorurato. Come avevamo visto la tossicità del cisplatino era legata al fatto che, una volta iniettato, reagiva velocemente con le proteine del sangue e solo una piccolissima frazione entrava nelle cellule. In effetti il carboplatino viene espulso dall’organismo in gran parte in forma non reagita e non presenta la oto- e nefrotossicità del cis-Pt, ma purtroppo porta ad una riduzione dell’attività del midollo osseo, e quindi ad una diminuzione di globuli rossi, bianchi e piastrine.
Studi approfonditi di reattività hanno mostrato che il carboplatino è poco affine verso i gruppi tiolici della cisteina e del glutatione, ma interagisce molto meglio con la metionina e con lo ione carbonato, entrambi presenti nel sangue in quantità apprezzabili. Anche il carboplatino va considerato solo come un precursore della specie veramente attiva, che è probabile sia molto simile a quella del cisplatino, considerando che anche il tipo di lesione prodotta nel DNA è la stessa. In particolare sembra che si leghi con i i residui di guanina, aprendo così l’anello chelante, che viene poi perso quando la molecola si lega con una seconda guanina.

 

Uno sguardo verso il futuro

Buona parte degli studi moderni sui farmaci a base di platino stanno andando oltre le classiche regole struttura-attività.
I composti trans stanno ad esempio tornando alla ribalta. Inizialmente furono scartati, in quanto più reattivi rispetto a quelli cis (e quindi più facilmente disattivabili) e perché formano più difficilmente i legami crociati intrafilamento necessari per bloccare la replicazione e la trascrizione del DNA. La sostituzione dell’ammoniaca presente nel trans-platino con ammine più complesse ha però portato a dei miglioramenti significativi nell’attività citotossica, promuovendo la formazione di legami DNA-platino-proteine difficilmente rimuovibili dai classici meccanismo di riparazione visti precedentemente.
chemioterapia e suo campo semanticoUna seconda via, ancora poco esplorata ma che promette ottimi risultati, è quella basata sull’utilizzo di complessi ottaedrici di Pt (IV), invece che di Pt (II). Come spiegato precedentemente, l’uso di derivati del Pt (IV) potrebbe presentare molti vantaggi, sia per quanto riguarda il trattamento di tumori cis-Pt resistenti sia per quanto riguarda l’eventuale loro somministrazione per via orale, sotto forma di pillole, migliorando così la qualità della vita del paziente ed evitandone l’ospedalizzazione. Ancora gli studi meccanicistici sono pochi, ma è molto probabile che questo tipo di molecole siano solo profarmaci che devono poi essere ridotti intracellularmente ad una specie di Pt (II) reattiva. Questa tipologia di complessi è infatti abbastanza inerte dal punto di vista chimico, il che ne permette la somministrazione orale e ne sfavorisce la disattivazione da parte del GSH e delle altre molecole e proteine che normalmente interagirebbero con il platino, ma potrebbe renderli poco efficaci come farmaci. Al momento l’unico farmaco a base di platino (IV) in fase clinica è il Satraplatin, che mostra una certa tossicità ematologica e gastrointestinale ma con assenza di neuro- e nefrotossicità.
La strada verso il “chemioterapico perfetto” è ovviamente ancora lunga e la fine è ben lungi dall’essere alla portata della vista dei ricercatori. Il cisplatino ha già attraversato cinquant’anni di studi e sperimentazioni e il design e la sintesi di nuovi farmaci a base di platino è ormai un campo abbastanza consolidato. Nonostante tutto questo, ancora sono presenti molte incertezze e molti lati oscuri, soprattutto per quanto riguarda l’esatta biochimica che ci sta dietro. Tuttavia il percorso che ha portato da una coltura di E. Coli un po’ spilungoni ad una serie di farmaci che hanno salvato e stanno ancora salvando milioni di vite non può non farci riflettere sull’importanza dell’intuizione, della fantasia e della ricerca di base. Se nessuno avesse finanziato quell’idea un po’ strana di Barnett Rosenberg, se egli stesso non avesse avuto la costanza e il raziocinio di non abbandonare quello che all’inizio sembrava solo un esperimento fallito, questo articolo non sarebbe stato scritto. Forse è quindi il caso di chiederci: quante altre meraviglie sono ancora nascoste dietro una banale ma mancata osservazione? Quante altre ricerche inconcluse, per mancanza di finanziamenti, di lungimiranza politica o perché non hanno dato il risultato aspettato, avrebbero potuto cambiare il mondo?

 

Bibliografia

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3 risposte a Come un metallo rivoluzionò la medicina: breve storia del cis-platino

  • Yvonne Postal scrive:

    molto interessante anche se anche molto adatto ad essere compreso da persone specializzate in materia. per me invece vi chiedo: che esami posso fare oltre alla pet-tac per avere risposte su di me, soddisfacenti?

  • Giuseppe Alonci scrive:

    Caro Marco,
    mi scuso per il ritardo, ma leggo solo ora il suo commento. Purtroppo la risposta alla sua domanda è che, semplicemente, non c’è una selettività particolarmente marcata. Per questo motivo presenta tutti questi effetti collaterali. Come ho riportato nell’articolo, alcune proteine sono direttamente coinvolte (o almeno così sembrano) nel trasporto della molecola fuori e dentro la cellula, quindi una espressione anomala di queste proteine potrebbe portare alcune cellule tumorali ad assorbire il cisplatino più favorevolmente, ma che io sappia al momento c’è veramente poco di certo!

  • Marco scrive:

    Bellissimo – quanto interessante – articolo!
    Ho però un dubbio, il cambiamento di morfologia del DNA, a causa del Pt, e di conseguenza l’avvio del processo di riparazione o apoptosi delle cellule, non dovrebbe avere una troppo importante influenza citotossica anche sulle cellule non tumorali, tale da causare una distruzione troppo imponente dell’organismo?
    A questo punto mi chiedo se il cis Pt non abbia una sorta di “specificità” per le cellule malate (o meglio, se le cellule malate non abbiano qualche meccanismo tale da acquisire il farmaco in quantità superiore alle sane).

    Grazie in anticipo per l’attenzione, purtroppo l’articolo è così interessante da non avermi permesso di non porgere una domanda, :D
    Marco

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