La replicazione artificiale del DNA: la PCR

di Sergio Barocci

La reazione polimerasica a catena o PCR

postazione di lavoro in cappa per PCRDa quando è stata ottenuta la duplicazione del DNA in laboratorio, è stato possibile fare copie multiple di una sequenza di DNA.  La reazione a catena della polimerasi o PCR da Polymerase Chain Reaction è una tecnica che automatizza questo processo copiando molte volte in provetta un tratto di DNA.  Tale tecnica è stata inventata dal biochimico americano Kary Mullis nel 1983 per la quale ottenne poi il Premio Nobel per la Chimica nel 1993 .  La reazione riproduce praticamente ciò che avviene nel nucleo delle cellule, ossia la replicazione del DNA, eseguita in modo artificiale.
Per allestire una reazione di PCR è necessario disporre di strumenti come un termociclatore, che è una sorta di fornetto in cui si dispongono dei campioni, solitamente posti in una pluripiastra a 96 pozzetti.

Uno dei primi prototipi di termociclatore contenente il software applicativo integrato nell'hardware

Uno dei primi prototipi di termociclatore contenente il software applicativo integrato nell’hardware

La reazione ha la funzione di amplificare un determinato tratto di materiale genetico ottenendone più copie dello stesso.  Al fine di rendere possibile tale procedimento è necessario preparare un campione contenente :
a)  il frammento di DNA da amplificare, presente come doppio filamento,
b)  oligonucleotidi liberi trifosfato, che occorrono come materia prima per sintetizzare i nuovi filamenti che saranno le copie del filamento iniziale,
c)  dei Primers (uno Forward e uno Reverse), che vengono disegnati in base a determinati software (che si possono scaricare da Internet come Free Download), che occorrono come iniziatori del processo di estensione dei filamenti, ossia come prontuario,
d) un enzima che provvede all’estensione dei filamenti, denominato Taq Polimerasi, ossia una DNA polimerasi Termoresistente estratta dal microrganismo, appartenente al Regno degli Archaea, Thermus acquaticus.

Il Thermus acquaticus è un batterio che vive nelle profondità oceaniche a ridosso delle sorgenti idrotermali adiacenti alle dorsali oceaniche e, quindi, in un ambiente dove esistono condizioni di temperatura e di pressione elevate.  La sua DNA Polimerasi è appunto termoresistente e funziona all’interno di un ben determinato range di temperatura.  Oltre a tali ingredienti, si deve aggiungere un tampone a base di ioni magnesio Mg++.
Una volta che i campioni sono stati preparati è necessario inserirli successivamente all’interno di un termociclatore, a sua volta è controllato da un computer direttamente connesso allo stesso, e procedere alla sintesi chimica.  Tale sintesi automatizzata si compone di cicli, divisi in tre fasi: la prima è detta fase di denaturazione e avviene portando la temperatura a 94°C per 1 minuto.

Thermus aquaticus - ambiente naturale e fotografia microscopica

Essa permette di denaturare i doppi filamenti di DNA che si devono amplificare , ottenendo cosi due singoli filamenti di cui, ciascuno di essi dovrà servire come Template Strands o Filamenti Stampo per la sintesi del filamento complementare.  La denaturazione avviene tramite la separazione dei due singoli filamenti a livello delle basi azotate.  Adenina o A e Timina o T sono connesse da un doppio ponte a idrogeno mentre le basi azotate Guanina o G e Citosina o C sono connesse da un triplo ponte a idrogeno. La seconda fase prende il nome di Annealing o Appaiamento e avviene abbassando la temperatura a 54°C e mantenendola per 45 secondi (3/4 di minuto).  Qui avviene l’appaiamento dei Primers che funzioneranno come iniziatori della reazione.  Infine si ha la Extension Phase o Fase di Estensione in cui viene applicata una temperatura di 72°C per 1 minuto.  In questa fase avviene l’azione della DNA Polimerasi Termoresistente che aggiunge un dNTP o desossiribonucleotidetrifosfato dopo l’altro, sui filamenti stampo che erano stati denaturati inizialmente. In pratica, ogni ciclo si compone di queste tre fasi. Alla fine del ciclo, da un singolo frammento a doppio filamento si otterrano due frammenti a doppio filamento e cosi via. La reazione procede grazie ad una amplificazione esponenziale dei filamenti. Cioè, alla fine del 1° ciclo si otterranno due frammenti a doppio filamento e poi… 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512, 1024, 2048, e cosi via. Teoricamente la reazione può procedere all’infinito ma, praticamente, dopo un po’, la curva che definisce la reazione si stabilizza a plateau in quanto i reagenti vengono a mancare in particolar modo gli oligonucleotidi trifosfato. Alla fine, dopo un certo numero di cicli, del filamento iniziale se ne potranno ottenere addirittura miliardi di copie, che poi si potranno separare facendo correre il DNA su di un gel di agarosio in una camera elettroforetica.

 

Biografia di Kary Banks Mullis

K.B. Mullis è nato a Lenoir nello stato della Carolina del Nord (U.S.A.) , il 28 dicembre 1944.  E’ un biochimico statunitense, vincitore del Premio Nobel per la Chimica nel 1993 per lo sviluppo della tecnica della reazione polimerasica a catena (Polymerase Chain Reaction o PCR), assieme a Michael Smith (1932 – 2000) (chimico inglese , che ricevette il Premio Nobel per la chimica nel 1993 per i suoi studi sulla mutagenesi a seguito della riorganizzazione degli oligonucleotidi e le sue implicazioni nello studio delle proteine), un processo già descritto da Kjell Kleppe e da Har Gobind Khorana, quest’ultimo Premio Nobel per la Medicina nel 1968),

Kary Banks Mullis (Lenoir, 28 dicembre 1944)

Kary Banks Mullis (Lenoir, 28 dicembre 1944)

K.B. Mullis ha ricevuto nel 1966 un Bachelor in chimica presso il Georgia Institute of Technology, conseguito nel 1972 un dottorato di ricerca in biochimica all’Università di Berkeley – California e tenuto conferenze sempre presso la stessa Università sino al 1973, anno in cui è diventato successivamente un borsista post-dottorato in cardiologia pediatrica presso la Medical School dell’Università del Kansas occupandosi dello studio della molecola dell’ angiotensina e della fisiologia vascolare polmonare. Nel 1977 ha iniziato a lavorare nel campo della chimica farmaceutica in California all’Università di San Francisco per poi aderire nel 1979 alla Cetus Corporation di Emeryville, California. D urante i suoi sette anni di permanenza in questa società, ha condotto ricerche sulla sintesi degli oligonucleotidi portandolo ad inventare la reazione a catena della polimerasi. Nel 1986, è stato nominato direttore di biologia molecolare presso Xytronyx, Inc. a San Diego, dove ha concentrato il suo lavoro nella tecnologia del DNA e nella fotochimica. Nel 1993 ha ricevuto il premio Nobel per la chimica per l’invenzione della PCR o reazione polimerasica a catena e anche il Japan Prize. Questa sua scoperta è oggi considerata una delle tecniche scientifiche monumentali del XX secolo. Tra i suoi numerosi riconoscimenti sono da menzionare “ la William Allan Memorial Award of the American Society of Human Genetics” (1990), “il Preis Biochemische Analytik of the German Society of Clinical Chemistry and Boehringer Mannheim” (1990), “il Premio Nazionale delle Biotecnoclogie” (1991), “ la Gairdner Foundation International Award, Toronto- Canada” (1991), “ la R&D Scientist of the Year “ (1991),” il California Scientist of the Year Award” (1992) e “ il Thomas A. Edison Award (1993)”.

Per quanto riguarda le sue numerose pubblicazioni sono in particolare da ricordare :

1.   The Cosmological Significance of Time Reversal” (Nature),
2.   “The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction” (Scientific American),
3.   “Primer-directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase” (Science),
4.   “Specific Synthesis of DNA In Vitro via a Polymerase Catalyzed Chain Reaction” (Methods in Enzymology).

Attualmente lavora come ricercatore presso il Children’s Hospital and Research Institute a Oakland fornendo inoltre consulenze scientifiche per diverse società, su questioni legali che riguardano il DNA.
Mullis è oggi considerato un personaggio alquanto originale e molto discusso per essersi scontrato diverse volte con le posizioni della comunità scientifica (critico nei confronti della teoria diffusamente accettata del legame HIV – AIDS e per lo scetticismo rispetto alle cause del riscaldamento globale e del buco nell’ozono). Inoltre, in una famosa intervista avrebbe anche affermato retoricamente che non sarebbe mai riuscito a scoprire la PCR se non avesse assunto LSD, ammettendo di avere imparato parecchio grazie a tale esperienza.

 

Storia della PCR

Tra i metodi principali della biologia molecolare attuale, la PCR è forse quella più utilizzata data la sua applicabilità a problematiche diagnostiche ed analisi routinarie di laboratorio oltre che a pratiche di ricerca scientifica. Inizialmente fu proposta da G. Khorana (1970) ma immediatamente abbandonata perché poco praticabile a quel tempo in quanto molti geni non erano stati sequenziati e non si conoscevano ancora le DNA polimerasi termostabili.

Har Gobind Khorana ( Raipur, 1922 – Concord, 2011)

Har Gobind Khorana ( Raipur, 1922 – Concord, 2011)

Har Gobind Khorana (1922 – 2011) è stato un biochimico indiano naturalizzato statunitense.
La sua ricerca medica si è svolta nell’ambito della decifrazione del codice genetico. Egli riuscì per primo a costruire in laboratorio degli RNA messaggeri monotoni nella ripetizione della coppia di nucleotidi CU (Citosina- Uracile) .
Non riuscì a ricavare informazioni precise sul significato delle triplette CUC (Citosina-Uracile-Citosina) e UCU (Uracile-Citosina-Uracile) , ma portò una definitiva dimostrazione del fatto che il codice genetico fosse a triplette: infatti la proteina che si formava in seguito alla lettura del messaggio era formata da due amminoacidi che si alternavano e se il codice genetico fosse stato a doppiette si sarebbe formata una proteina monotona (lo stesso sarebbe successo se fosse stato a gruppi di 4 nucleotidi).
Nel 1968 ricevette il Premio Nobel per la Fisiologia e la Medicina insieme a Marshall Warren Nirenberg e a Robert William Holley per le ricerche nella descrizione del codice genetico e sul suo ruolo nella sintesi delle proteine nelle cellule.

Kjell Kleppe(1934-1988)

Kjell Kleppe(1934-1988)

K. Kleppe ( 1934 – 1988 ) è stato un biochimico norvegese che ha descritto il principio della reazione a catena della polimerasi (polymerase chain reaction o PCR ) già nel 1971 in un articolo da lui pubblicato con il Premio Nobel Gobind Khorana di cui era un collaboratore presso l’Università del Wisconsin.
Nel 1985 la reazione fu proposta da K Mullis e coll. che mostrarono l’amplificazione in vitro di geni di mammifero utilizzando il frammento Klenow della DNA polimerasi I di Escheria Coli. La vera rivoluzione avvenne quando furono purificate e rese disponibili le prime DNA polimerasi termostabili (Saiki e coll. 19988) che ne innalzarono notevolemente l’efficienza fornendo anche la possibilià di automatizzare la reazione di PCR senza dover aggiungere l’enzima fresco ad ogni ciclo.

LE VARIANTI DELLA PCR

La PCR ha la peculiarità di essere una reazione molto veloce e flessibile e ciò ha permesso la nascita in questi ultimi anni di un certo numero di varianti dello schema di base ( PCR – RT, Nested – PCR , Real time – PCR ecc.) e di un enorme numero di applicazioni nei più svariati settori della ricerca biologica e dell’analisi clinica perché consente la moltiplicazione o meglio l’amplificazione di frammenti di acidi nucleici conoscendo le loro sequenze nucleotidiche iniziali e terminali. Per tale motivo viene oggi considerata uno dei passi fondamentali che hanno condotto al moderno sviluppo delle biotecnologie.

le fasi di una PCR

le fasi di una PCR

Schema delle fasi di una PCR:

1.  Denaturazione
2.  Annealing
3.  Allungamento
4.  Termine del ciclo

In linea teorica ogni ciclo dovrebbe raddoppiare la quantità di DNA; tuttavia ciò non si realizza. Per avere una stima sufficientemente attendibile del numero di filamenti di DNA ottenuti dopo cicli si può ricorrere alla formula:

dove:
= DNA prodotto dopo cicli ; = quantità iniziale di DNA presente ; = numero di cicli di PCR effettuati ; = efficienza dell’amplificazione (in genere compresa tra 0,7 e 0,8)

 

Il meccanismo di funzionamento della PCR

La PCR permette l’amplificazione di una regione specifica di DNA, sfruttando alcune peculiarità della duplicazione del DNA ad opera della DNA polimerasi come:
1. la necessità di un DNA a filamento singolo come stampo per la sintesi di un filamento complementare,
2. la necessità di un piccolo DNA innesco per iniziare la sintesi,
3. la sintesi del DNA solo in direzione 5’ 3’

meccanismo di funzionamento della PCR

meccanismo di funzionamento della PCR

Lo stampo di DNA a filamento singolo può essere prodotto semplicemente riscaldando il DNA a doppia elica a temperature prossime a quella di ebollizione (denaturazione del DNA). Il punto d’inizio della sintesi del DNA può essere specificato fornendo come innesco un corto oligonucleotide (primer) che si appai allo stampo nelle immediate vicinanze del segmento di DNA che si vuole amplificare.
Aggiungendo un primer oligonucleotidico per ciascun filamento, entrambi i filamenti di DNA possono servire da stampo. Il miscuglio di reazione viene quindi nuovamente scaldato in modo da separare i filamenti originari da quelli neosintetizzati, che sono così nuovamente disponibili per un ulteriore ciclo di ibridizzazione con i primers, sintesi del DNA e separazione dei filamenti. Al termine di n cicli, il miscuglio di reazione contiene un numero massimo teorico di molecole di DNA a doppia elica pari a 2n. Tali molecole sono le copie della sequenza di DNA compresa tra i due primers. Il materiale di partenza per la PCR è il DNA che contiene la sequenza che deve essere amplificata; non è necessario isolare questa sequenza dal momento che essa viene individuata dai primers. La quantità di DNA necessaria per la PCR è veramente piccola (meno di 1 μg di DNA genomico totale, ma a volte basta una singola molecola di DNA).

Composizione tipica di una reazione di PCR:

• DNA contenente la sequenza da amplificare
• Due primers
• DNA polimerasi
• Miscela dei quattro nucleotidi precursori (dNTPs: 2’ desossinucleosidi 5’ trifosfato)
Il volume totale della reazione è generalmente di circa 50-100 μl

Ad ogni ciclo il numero dei frammenti desiderati (quelli cioè posti tra i due primers) si raddoppia (crescita esponenziale), mentre di nuovi frammenti estesi all’estremo 3’ ad ogni ciclo se ne formano sempre e solo due. Dopo 32 cicli si sono perciò formati 1 073 741 824. frammenti di DNA a doppia elica corrispondenti al tratto compreso tra i due primers (e solo 64 filamenti estesi all’estremo 3’). Dopo l’ultimo ciclo si lascia il campione per 10 min. a 72°C. In questa maniera l’enzima ha il tempo di riempire ogni lacuna che dovesse essere eventualmente presente all’estremo 3’ di qualche filamento.

provette per PCR

provette per PCR

Originariamente per la PCR veniva impiegata la DNA polimerasi di E. Coli, ma questo enzima è termolabile, per cui a 94° viene inattivato. Di conseguenza ad ogni ciclo bisognava aggiungere nuovo enzima. L’isolamento della DNA polimerasi di Thermus aquaticus (Taq polimerasi) che vive in sorgenti termali alla temperatura di 75°C ha permesso di ovviare a questo inconveniente.

Vantaggi dell’uso della Taq polimerasi:

1.   L’enzima può essere aggiunto una sola volta all’inizio della reazione e rimane attivo per 30-40 cicli di PCR.
2.   E’ così possibile automatizzare la PCR utilizzando apparecchi termostatici ciclici.
3.   La Taq polimerasi aumenta la specificità e la sensibilità della PCR.

Alla temperatura più bassa necessaria per la DNA polimerasi di E. Coli, i primers possono appaiarsi con il DNA in siti dove le sequenze possono essere leggermente diverse dalla sequenza bersaglio (mismatch). Se questi “mismatch” dei primers si trovano su filamenti opposti del DNA in posizioni molto vicine può verificarsi un’amplificazione aspecifica.

 

Forme superavvolte del plasmide pT7 (2.8 kb). Al centro: immagine TEM dopo 'spreading' con citocromo-c/formammide, impregnazione con acetato d'uranile e ombratura circolare con platino. Sopra/Sotto (vista 3D): immagini AFM dopo adsorbimento su mica in presenza di ioni magnesio.

Forme superavvolte del plasmide pT7 (2.8 kb). Al centro: immagine TEM dopo ‘spreading’ con citocromo-c/formammide, impregnazione con acetato d’uranile e ombratura circolare con platino. Sopra/Sotto (vista 3D): immagini AFM dopo adsorbimento su mica in presenza di ioni magnesio.

Fonti di DNA per la PCR:

1.    DNA genomico totale estratto dalle cellule anche solo per bollitura.
2.    cDNA ottenuto dall’mRNA mediante la transcriptasi inversa.

Il DNA è una molecola molto stabile e per la PCR viene utilizzato il DNA proveniente dalle fonti più strane:

1.    DNA virale in frammenti bioptici di carcinoma della cervice uterina inclusi in paraffina 40 anni prima.
2.    DNA da goccioline di sangue essiccate per anni su carta da filtro.
3.    DNA isolato da mummie egiziane.
4.    DNA isolato da pelli di animali ormai estinti.
5.    DNA di foglie fossili vecchie di 18 milioni di anni.

 

Applicazioni della PCR

La PCR viene utilizzata in tutte quelle situazioni in cui bisogna amplificare un quantitativo di DNA fino a livelli utili per analisi successive.
I campi di applicazione sono enormi.  La tecnica viene sfruttata, per esempio, in medicina per la diagnostica microbiologica o per l’evidenziazione di cellule tumorali, in tumori liquidi, quando esse sono troppo poche per essere evidenziate da altre metodiche (malattia minima residua).  Estremamente utile è l’uso della PCR in medicina legale.
In biologia la PCR viene usata per le analisi di paleontologia e di antropologia molecolare ed in numerosi campi dell’ingegneria genetica.  Fondamentale è poi il suo utilizzo per lo studio del genoma di organismi non coltivabili, quali numerosi batteri e protisti, e per lo studio di popolazioni in ecologia.  Le diverse gradazioni di specificità dei primer integrate alla diversa efficienza con cui essi si legano all’amplificato a seconda della temperatura garantiscono a questa tecnica una straordinaria flessibilità per studi a tutti i diversi livelli tassonomici.

 

esempi di attuali (2012 ) termociclatori per PCR

esempi di attuali (2012 ) termociclatori per PCR

I principali utilizzi della PCR:

• Diagnosi infezioni batteriche e virali
• Diagnosi HIV mediante PCR
• Diagnosi epatite B (HBV) e C (HCV)
• Diagnosi di Tubercolosi mediante PCR
• Diagnosi cliniche di malattie causate da mutazioni:
• Diagnosi prenatale di emofilia effettuata mediante PCR
• Controllo efficacia terapie anti-cancro:
• Diagnosi mediante PCR dei linfomi follicolari
• Compatibilità tissutale nel campo dei trapianti di organi solidi e di cellule staminali
• Determinazione del sesso
• Studi evoluzione molecolare
• Classificazione piante fossili

Bibliografia essenziale

Williams 1990: Williams, John G.K. e altri, DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers, “Nucleic acids research”, 18, 1990, pages 6531-6535.

“The History of PCR”. Smithsonian Institution Archives

 

 

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