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microrganismi in cattività: quando la sintesi chimica ricorre al bioreattore

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Se le piante si coltivano nei campi oppure nelle serre, i bovini si allevano nelle stalle o sui pascoli, le galline nei pollai e le pecore negli ovili, quando vogliamo allevare i microrganismi con finalità produttive, li trattiamo nei fermentatori.

bioreattore pilota con utilities connesseI fermentatori sono degli speciali contenitori, spesso davvero superaccessoriati e dotati di raffinatissimi controlli, in qualche caso molto ma molto più caserecci, dove i microrganismi sono mantenuti in vita e fatti riprodurre, nelle migliori condizioni richieste per la loro esistenza o, come capita spesso per gli animali e le piante d’allevamento (per quanto la cosa risulti davvero triste) nelle condizioni migliori per poterli sfruttare a fini produttivi.
Batteri di ogni tipo, aerobi ed anaerobi, compresi quelli che desiderano sì un po’ di ossigeno ma guai a dargliene più di un tot, funghi di ogni tipo, dalle classiche muffe filamentose agli Saccharomyces cerevisiae - il fungo ascomicete unicellulare che costituisce lo lievito di birralieviti, che sono di fatto sempre una tipologia di funghi, ma unicellulari: tutta questa variegata casistica di microrganismi ed altri ancora possono essere allevati su scala di laboratorio o in impianti di dimensioni grandissime, dove il cuore del sistema, comunque lo si consideri, consiste sempre in un a grossa cisterna cilindrica, talvolta allestita con controlli ed attuatori degni, direbbe qualcuno, di una centrale nucleare, ma pur sempre di una cisterna si tratta, dove miliardi e miliardi di microrganismi, tutti della stessa specie e per lo più anche dello stesso ceppo genetico, se ne stanno tutti insieme a vivere e riprodursi in condizioni di concentrazione in confronto delle quali le galline in batteria avrebbero a disposizione una villa con piscina.

corpo cilindrico di un fermentatore prima del montaggioTutti insieme a bagno, dal momento che per una molteplicità di ragioni che saranno facilmente comprese più avanti nella trattazione, le fermentazioni vengono solitamente condotte in dispersione acquosa del microrganismo, e quello che il fermentatore si trova normalmente a contenere è una massa liquida più o meno viscosa e torbida, quello che solitamente viene definito “brodo di fermentazione”.

Ma cosa mai potranno produrre batteri e lieviti di così interessante ed utile da giustificare degli investimenti strutturali in impianti industriali che spesso raggiungono il valore di milioni di euro?
Sembra poco se parliamo di farmaci, ed in particolare di principi attivi ormai indispensabili nella nostra civiltà come parecchi tipi di antibiotici?  O piccole molecole in grado di polimerizzare con la possibilità di essere sfruttate dall’industria dei polimeri plastici?    E che dire degli enzimi, utilizzati a loro volta nei più disparati campi della nostra esistenza (dai detersivi per il bucato all’industria della trasformazione alimentare) prodotti anch’essi dall’attività fermentativa?  O ancora altre piccole molecole come l’acido ascorbico (vitamina C), l’acido citrico (sì, lo stesso che contribuisce a rendere acido il succo degli agrumi) e tante altre sostanze ampiamente utilizzate dall’industria alimentare, cosmetica e farmaceutica?
classici fermentatori in rame utilizzati nell'industria della birraSempre rimanendo nel contesto alimentare, non pensiamo che il processo con il quale trasformiamo il mostro d’uva in vino ed il malto in birra siano basati su qualcosa di molto diverso: sono processi di fermentazione conosciuti da migliaia di anni ed i microrganismi che partecipano ad essi (essenzialmente lieviti) si sono nel frattempo ben irrobustiti e stabilizzati anche dal punto di vista genetico, tanto che questi processi possono oggi essere condotti anche in modo tutto sommato “agricolo” senza particolari forme di controllo in linea, ma sempre di fermentazioni si tratta, o per essere più precisi di trasformazioni della composizione chimica della materia mediate, quasi catalizzate, da un microrganismo.

Il termine “fermentazione” è spesso utilizzato, in buona parte a sproposito, per indicare qualsiasi tipo di trasformazione della composizione chimica della materia operata da microrganismi, mentre tanto i microbiologi quanto i biochimici insistono nel puntualizzare che le fermentazioni propriamente dette corrispondono solo ad una parte, probabilmente neanche la più rappresentativa, delle trasformazioni suddette.    Ho riservato al termine di questo articolo una sezione speciale di approfondimento per chiarire la differenza effettiva fra i processi fermentativi propriamente detti e le biotrasformazioni e biosintesi microbiche più in generale.
Sta di fatto che nel linguaggio corrente le apparecchiature utilizzate, più correttamente definibili “bioreattori”, prendono comunemente il nome di fermentatori al di là della specificità del processo che il microrganismo andrà ad operare all’interno di esso, ed anche i corsi universitari sull’argomento, come quello che ho avuto modo di frequentare presso l’Università degli Studi di Torino negli anni ’90, assumono denominazioni del tipo “chimica delle fermentazioni e batteriologia industriale”, pur trattando di argomenti che vanno ben al di là del processo di fermentazione propriamente detto.       Pertanto d’ora in avanti utilizzerò quasi sempre il termine “fermentazione” fra virgolette, consigliando caldamente il lettore ad approfondire questo importante distinguo nell’ultima sezione di questo testo.

Quello che vogliamo ora considerare, al di là di come lo si voglia nominare, è un generico processo, un accadimento naturale o pilotato dall’uomo, dove dei microrganismi vivi, attraverso uno o nella maggior parte dei casi numerosi passaggi biochimici, effettuano delle trasformazioni chimiche a carico, direttamente o indirettamente, delle sostanze chimiche che vengono loro fornite.
cubetti lievito di birra (Saccharomyces cerevisiae)Queste trasformazioni possono essere effettuate a carico delle sostanze nutritive che essi assimilano, semplicemente producendo la cosiddetta “biomassa”, che altro non è che il loro stesso corpiccino, miliardi e miliardi di corpicini di batteri o di lieviti, vivi o morti che siano, appressati l’un l’altro, magari scolati dall’acqua nella quale si trovavano immersi, da impiegarsi per gli scopi più diversi, in primo luogo per l’alimentazione animale ed umana: i cubetti di lievito di birra, che acquistiamo nei negozi e con i quali prepariamo svariate ricette come l’impasto per la pizza, sono biomassa compressa, quindi miliardi e miliardi di cellule vive, dello lievito Saccharomyces cerevisiae, detto appunto “lievito di birra”, in dipendenza dal primo settore industriale che ha visto (e vede tutt’ora) l’impiego più massivo di questa specie.
Ma le straordinarie performances di sintesi e trasformazione delle quali sono capaci i microrganismi possono essere sfruttate non soltanto per produrre biomassa, bensì come ho avuto modo di anticipare in precedenza, anche molecole chimicamente ben definite e di specifico interesse applicativo per l’uomo.   Queste a loro volta possono essere prodotte a partire dalla normale dieta del microrganismo (es. glucosio, una fonte azotata, sali minerali, ossigeno, ecc), come uno dei tantissimi metaboliti, ovvero come una delle molecole normalmente prodotte nell’ambito del loro metabolismo.    In questo caso di parla di biosintesi di una certa molecola, come ad esempio di un enzima o di una vitamina: il batterio o il fungo già producono naturalmente questa specie chimica, ma noi li selezioniamo e/o modifichiamo su base genetica, e li coltiviamo nelle condizioni opportune per fargliene produrre molta, molta di più.

microrganismi di interesse industriale nel 1981

(clicca per ingrandire)

Oppure può trattarsi di molecole del tutto estranee al metabolismo del microrganismo in questione (le cosiddette molecole xenobiotiche), che possono essere prodotte con un numero limitato di passaggi (talvolta che con una reazione soltanto) a partire da un precursore chimico che introduciamo allo scopo nel cosiddetto “brodo di fermentazione”. In questo caso si fornisce al microrganismo il suo alimento abituale, ed in più una sostanza per lui estranea e probabilmente neppure utile, che però risulta in grado di trasformare in qualcos’altro, al pari di un’ostrica che trasforma in una perla quel fastidiosissimo granello di sabbia che gli allevatori introducono a forza fra le sue valve.   Una trasformazione che se operata artificialmente dall’uomo, con metodi chimico-sintetici tradizionali, comporterebbe costi e possibili “imperfezioni” spesso davvero insostenibili, mentre con l’aiuto di microrganismi specifici può risultare, oltre che economicamente vantaggiosa, anche estremamente mirata e selettiva.   Si parla in questo caso di biotrasformazioni.

 

Tornando alla infinita gamma di molecole che possono essere prodotte dai processi di biotrasformazione microbiologica industriale, possiamo persino arrivare ad accostare il settore “fermentativo” alle tradizionali commodities primarie come i materiali organici fossili (petrolio, carbone e metano in primo luogo), i prodotti dell’estrazione mineraria ed i prodotti agricoli/forestali.     Segno che non stiamo parlando di uno o di alcuni prodotti, e nemmeno di un gruppo limitati di microrganismi.   Parlando di sintesi microbiologiche stiamo parlando di un modo del tutto nuovo di attingere sostanze chimiche anche pure dalla natura o, guardando la cosa dall’altro punto di vista, di piegare la natura alla produzione delle molecole che sono ritenute importati per la vita dell’uomo.
…un modo relativamente nuovo, dicevamo?

Bè, come capita quasi sempre in questi casi nella storia dell’umanità, i fenomeni vengono osservati e sfruttati ben prima della loro effettiva comprensione.   E’ successo così con la sintesi chimica, è successo così con la profilassi igienica, con la coltivazione delle piante e con l’astronomia: nel nostro caso non era di certo necessario agli antichi conoscere le vie biochimiche degli lieviti, ed anzi, non era neppure indispensabile conoscere la natura della loro esistenza (ovvero che si trattasse di funghi unicellulari, microscopici) per poterli sfruttare per trasformare i carboidrati in etanolo nella produzione del vino e della birra, o dei formaggi fermentati o dello stesso yogurt.

formaggio GorgonzolaSì, effettivamente è difficile trovare una cultura, un’epoca, una popolazione al mondo dove non vengano sfruttate da tempi immemorabili fermentazioni microbiologiche per la preparazione di qualche prodotto utile, ed in particolare di alimenti e bevande.
Tutt’altro discorso vale invece per l’altro pallino della specie umana: oltre al voler sfruttare, anche quello di “voler sapere” il perché ed il percome di qualcosa che di fatto già accade… che essenzialmente resta poi funzionale alla finalità di sfruttare meglio, con maggiore qualità, riproducibilità e resa lo stesso fenomeno, con la buona pace dei ricercatori puri che (mi metto per primo in testa alla lista) porrebbero i loro quesiti intellettuali in cima alla lista delle priorità, come ragione e scopo della loro attività.   Ecco, se portiamo tutto questo sul piano delle scoperte scientifiche, la conoscenza relativa alle fermentazioni e più in generale alle trasformazioni microbiologiche si arricchisce di nomi e cognomi, e di date piuttosto recenti.


CREARE L’AMBIENTE DI VITA IDEALE

Abbiamo precedentemente anticipato come, dal punto di vista puramente concettuale, il cuore dell’impianto in piccola o grande scala nel quale si possono far avvenire le fermentazioni (che ora chiameremo giustamente “fermentatore”) consiste in una sorta di bidone, o di cisterna, o serbatoio che di si voglia.
mosto uva in fermentazione in un tinoNei casi più semplici questa descrizione corrisponde abbastanza da vicino alla realtà: è il caso, per esempio, di quando si utilizza un microrganismo particolarmente robusto ed in grado di prevalere, sia nel numero che nelle capacità di sopraffazione, rispetto alla maggior parte degli altri microrganismi competitori, ubiquitari nell’ambiente, oppure del caso nel quale le condizioni di processo (es. il pH del substrato, la temperatura, la presenza di alcuni componenti) sono piuttosto selettive da inibire la crescita della maggior parte degli altri microrganismi indesiderati, o anche dell’eventualità nella quale i microrganismi ambientali non risultino poi così fastidiosi ed anzi possano addirittura risultare utili alla generazione di componenti secondari nel prodotto finito (es. molti prodotti alimentari della tradizione, quali formaggi).

Si tratta di casi-limite, legati solitamente più al settore della trasformazione agro-alimentare, ma è giusto affrontare da subito questo doveroso distinguo.    In molti di questi casi la condizione di assoluta sterilità dei contenitori, della strumentazione e delle stesse soluzioni, una delle poche condizioni di solito definite irrinunciabili per approcciare un processo di fermentazione controllata, può essere affrontata in modo critico, iniziando per esempio a domandarsi se una semplice “sanitarizzazione”, volta ad abbassare ma non necessariamente ad azzerare la carica microbica di strumentazioni e soluzioni, non risulti di fatto sufficiente, piuttosto che affrontare una sterilizzazione assoluta dell’ambiente di coltivazione e delle stesse soluzioni utilizzate.
membrane filtranti a cartuccia sterilizzanti per la sterilizzazione di aria e soluzioni acquoseLa sterilizzazione viene solitamente effettuata con vapore d’acqua ad alta temperatura, in altri casi con sostanze chimiche biocide che devono poi essere necessariamente lavate via con abbondanti dosi di acqua microbiologicamente pura.  Le soluzioni da introdurre, da subito oppure in seguito nel corso della fermentazione (es. terreno di coltura, soluzioni tampone per compensare le variazioni di pH, soluzioni del substrato sul quale operare la biotrasformazione, ecc) sono solitamente sterilizzati in autoclave (quindi in contenitori ermetici pressurizzabili, ad una temperatura superiore a quella di ebollizione del solvente, es.>100°C per l’acqua), o anche con mezzi fisici, quali il passaggio attraverso finissime membrane di microfiltrazione (con porosità inferiore a 2 micron, ovvero inferiori alla dimensione media di una cellula batterica) o attraverso ugelli che impartiscono temporaneamente alle soluzioni una pressione talmente elevata da rompere la stessa parete cellulare batterica.
autoclave da laboratorio per la sterilizzazione con acqua surriscaldata di oggetti e soluzioniOgni oggetto, materiale, soluzione, tubazione, anfratto ed interstizio delle apparecchiature che verranno a contatto con i microrganismi dovrà essere dunque scrupolosamente sterilizzata, quindi gli impianti stessi saranno costruiti secondo una logica che consenta il facile raggiungimento da parte dell’agente sterilizzante di ogni loro parte.   Dopo sterilizzazione ciascun componente non potrà entrare in contatto con altri oggetti o materiali non sterili, e neppure rimanere esposta all’aria.   La ragione di questa richiesta di elevata sterilità risiede nel fatto che, a parte i pochi casi “storici” riportati in premessa, quelli che andiamo ad allevare sono un po’ come delle orchidee tropicali nella Pianura Padana: non solo esse dovranno fronteggiare dei problemi oggettivi ed individuali per sopravvivere (es. temperatura, umidità, luce, tipo di terreno inadeguati…) ma soccomberanno con tutta probabilità sotto l’effetto della crescita di centinaia di altre specie vegetali autoctone, più robuste proprio perché maggiormente adattate a quell’ambiente specifico, e a crescita così veloce che nel giro di poco tempo arriveranno letteralmente a “soffocare” le nostre splendide da gracilissime orchidee tropicali.     Ecco, i microrganismi che vorremmo allevare per operare le biosintesi o le biotrasformazioni di nostro interesse, spesso soccomberebbero sotto la proliferazione preferenziale di altri microrganismi già presenti, anche a livello di semplice contaminazione, in un ambiente non sufficientemente sterile.
Ci sono poi le condizioni di vita specifiche del microrganismo d’interesse, che spesso non corrispondono esattamente alle condizioni per ottenere da essi la produzione desiderata. Mi spiego meglio.

introduzione di inoculo in impianto fermentazioneQuando si dispone di un fermentatore ormai già perfettamente sterilizzato, con dentro di esso caricato il volume necessario di soluzione acquosa nutritiva anch’essa sterilizzata, si introduce (in linguaggio microbiologico di “inocula”) una piccola quantità di un concentrato purissimo del microrganismo.     Si tratta in pratica di una semina, ed il seme in questo caso è preparato da uno speciale laboratorio interno o esterno all’azienda che tratta la fermentazione, ed in molti casi conservato in forma stabilizzata, ad esempio sottoforma di liofilizzato o a bassissima temperatura, ovvero in condizioni tali da mantenere in vita questi microrganismi o le loro spore, senza indurne però ancora la moltiplicazione.

Una volta introdotto questo inoculo nel fermentatore, dobbiamo fare in modo che questi microrganismi si risveglino (nel caso dell’inoculo di spore) e soprattutto si moltiplichino il più velocemente possibile e nelle migliori condizioni di salute, in modo tale da raggiungere dopo un certo periodo (solitamente sull’ordine dei giorni) la quantità in numero, o in peso, di microrganismi desiderata in relazione al volume del fermentatore ed al tipo di processo che intendiamo svolgere.    Questa fase, che risponde al richiamo biblico “crescete e moltiplicatevi” prende il nome di fase vegetativa, che nella pratica industriale di distinguerà dalla successiva fase di messa in produzione, dove i microrganismi non cresceranno ulteriormente in numero ma, eventualmente sotto l’influenza di condizioni ambientali diverse, effettueranno le biosintesi o le biotrasformazioni desiderate.

Parametri fondamentali da monitorare e sui quali eventualmente intervenire per consentire una ottimale crescita vegetativa tanto di batteri quanto di lieviti o altre tipologie di funghi, sono:

  • la fonte energetica (composizione chimica e la concentrazione), solitamente un carboidrato semplice;
  • una fonte azotata (es. ammonio solfato, urea, nitrati, peptone, ecc);
  • altri sali minerali;
  • fattori di crescita specifici;
  • la temperatura;
  • il pH;
  • la quantità di ossigeno e/o di anidride carbonica (per i microrganismi fotosintetici);
  • la luce;
  • l’agitazione/quiete della massa in fermentazione

illuminazione in bioreattori da laboratorio per alghe verdi fotosinteticheA differenza degli organismi più grandi, come le piante e gli animali, non possiamo valutare il benessere dei microrganismi semplicemente osservandoli.   Non ci sono foglie che appassiscono o che cadono, né iniziano a lamentarsi o si siedono in un angolo come gli animali da compagnia.   I microrganismi in condizioni di disagio riducono (o sospendono del tutto) il loro tasso di moltiplicazione, nei casi estremi muoiono, oppure (quando saranno entrati nella fase produttiva) smettono di produrre le sostanze desiderate, quelle per le quali abbiamo allestito tutto il sistema di allevamento, ed eventualmente iniziano a produrne di indesiderate.      Questi sintomi di disagio sono certamente monitorabili, ma nel più dei casi quando essi si verificano è già troppo tardi, e se anche non dovessimo buttare via tutto il contenuto più o meno vivo del nostro fermentatore, un danno economico già ci sarebbe stato.

Prevenire è meglio che curare, e solitamente quando si inizia una fermentazione su scala industriale si dispone già di una quantità sufficiente di informazioni relative alle necessità ed alle condizioni ottimali sia per la fase di crescita che per quella di produzione interessati.
prelievo campioni da bioreattore per accertamenti analitici offline in laboratorioUn qualsiasi fermentatore che si rispetti, tanto su scala pilota che industriale, è dotato di un apparato di sensori di controllo in grado di monitorare in continuo tutti i parametri richiesti, dalla temperatura al pH, dalla concentrazione di ossigeno alla pressione (che si origina in seguito a molte attività fermentative).     In aggiunta a questa sensoristica è in ogni caso previsto un campionatore per il prelievo “una tantum” di una piccola quantità di brodo di coltura per verificare su di esso con analisi offline, ovvero non in tempo reale sull’impianto bensì condotte in un laboratorio di servizio, la concentrazione di alcune importanti molecole in soluzione, come ad esempio gli stessi carboidrati di nutrimento, la fonte azotata, gli altri sali minerali, gli eventuali prodotti della fermentazione, ed anche l’entità della biomassa in crescita, ovvero la concentrazione di microrganismi raggiunta per millilitro di brodo, ed eventualmente quanti di questi risultano effettivamente attivi.
Con moderne tecnologie, ed in particolare per mezzo della spettroscopia nel vicino infrarosso (NIR) è possibile effettuare analisi non distruttive ed in continuo, senza la necessità di prelevare materialmente il campione, anche su questi importanti parametri chimici, ed addirittura di stimare la biomassa medesima che, come è facile comprendere, non può certo essere considerata di primo acchito un parametro chimico.

schema di bioreattore

Nei casi più sofisticati, e grazie anche al progressivo abbattimento dei costi di queste tecnologie anche a quelli meno critici, tutte le informazioni raccolte dai sensori descritti sono trasmesse in tempo reale ad un computer di controllo, che oltre a visualizzarli in una schermata unica che consente all’operatore umano di avere un colpo d’occhio immediato sulla situazione, permette la registrazione dell’evoluzione di questi parametri nel corso del processo di fermentazione.   Se sono stati preventivamente registrati i valori di riferimento sonde di misurazione per fermentatori e soluzioni calibrazionedi questi parametri (es. il pH ideale, la temperatura ideale, la concentrazione di ossigeno ideale, ecc) lo stesso PC è inoltre in grado di gestire un ritorno in feed-back delle stesse informazioni raccolte tramite i sensori, tramutandole in comandi operativi, sempre di tipo elettronico, su altrettanti attuatori, ovvero piccoli apparecchi o accessori montati sopra o in prossimità del fermentatore che consentiranno l’intervento automatico per compensare quei parametri di processo che si stanno gradualmente avviando alla deriva. Ad esempio se registriamo una temperatura troppo bassa rispetto alle specifiche richieste per quel tipo di microrganismo, il PC fornirà in consenso all’alimentazione elettrica di una resistenza posta nell’incamiciatura del fermentatore, o anche l’apertura parziale di una valvola che farà circolare nella sua intercapedine eterna dell’acqua calda.    Al contrario, se la temperatura registrata in tempo reale dovesse risultare troppo alta rispetto al valore ideale preventivamente immesso nello stesso PC, verrebbe istantaneamente trasmesso un controllo da i-Phone dell'andamento dei parametri di processo in una biotrasformazionecomando finalizzato all’apertura di valvole verso un circuito di refrigerazione.   Tanto la carenza di nutrienti quanto le problematiche relative al pH (che nel più dei casi tende a ridursi nel corso del processo) sono compensati tramite l’introduzione di soluzioni acquose sterili, pompate nella dose richiesta tramite piccole pompe peristaltiche, anch’esse comandate in modo automatico tramite il sistema PC di controllo ed attuazione.
Addirittura tramite dispositivi mobili,, come quello riportato nell’immagine a lato, grazie ad applicativi specifici è oggi possibile per lo meno “monitorare” in tempo reale l’andamento dei più importanti parametri

Il parametro aerazione è controllato solitamente tramite l’insufflazione di aria (contenente ossigeno) o, al contrario nel caso di un eccesso, alla sua rimozione tramite sostituzione di parte della stessa dallo spazio di testa soprastante il brodo di coltura, con un gas inerte quale azoto, utile comunque a mantenere la pressione “atmosferica” sopra alla biomassa in crescita.

agitatore verticale a tre eliche per fermentatoreL’agitazione è un altro parametro fondamentale, che insieme all’accessibilità di tutte le parti ed interstizi in fase di sterilizzazione, costituisce una delle finalità progettuali fondamentali in sede di perfezionamento del progetto di realizzazione di un nuovo fermentatore.   L’agitazione è realizzata solitamente tramite un’elica collegata ad un albero e quindi da un motore esterno, ed è collocata nella parte bassa del contenitore cilindrico; per ottimizzare l’agitazione (per evitare che la massa, spesso piuttosto viscosa, giri tutta insieme senza per altro mescolarsi opportunamente) sono talvolta poste delle alette sulle pareti interne del fermentatore.   Le funzioni dell’agitazione sono molteplici: migliorare la distribuzione uniforme delle sostanze nutritive aggiunte, specie nel corso del processo, e ridistribuire meglio nella massa quelle prodotte, evitando così il loro accumulo in prossimità del microrganismo che le ha prodotte, ma anche migliorare la distribuzione dell’aria e l’allontanamento dei gas sottoprodotti (es. anidride carbonica), migliorare lo scambio termico rispetto alle pareti termostatate, ed infine impedire che si formino delle masse più o meno compatte (colonie) di microrganismi sulle pareti o sulle altre parti interne del fermentatore.   Nella maggior parte dei casi, infatti, è auspicabile per più di una ragione, mantenere i singoli organismi unicellulari separati l’uno dall’altro, o se non altro evitare che essi si aggreghino in masse macroscopiche, dal momento che le cellule meno superficiali della colonia, ovvero quelle più interne, sarebbero presumibilmente esposte a condizioni ambientali diverse da quelle delle cellule superficiali o disperse, ed in modo specifico a condizioni differenti da quelle desiderate e monitorate in tempo reale nella soluzione.

micelio fungino costituito da ife filamentoseLa gestione delle modalità di agitazione rischia di divenire ancora più critica per quei microrganismi come i funghi diversi dagli lieviti, ovvero i funghi filamentosi (la maggior parte degli appartenenti al regno Mycota), che proprio per loro natura richiederebbero per il loro benessere condizioni di sufficiente quiete per poter sviluppare le loro ife filamentose, fino all’organizzazione di strutture macroscopiche visibili ad occhio nudo.


STRATEGIE PER LA PRODUZIONE

Quando si verifica che la concentrazione di cellule batteriche o di lieviti ha raggiunto il valore desiderato, che solitamente corrisponde al valore di plateau nella loro curva di crescita, ovvero quando il numero di nuovi nati equipara il numero dei decessi, si può entrare nella fase cosiddetta produttiva.

Nel caso in cui cosa interessa sia semplicemente la biomassa (es. per la produzione dei panetti di lievito di birra) ci si limiterà a scaricare, filtrare e scolare un po’ la massa degli lieviti, che sarà quindi compattata nelle tradizionali formelle che troviamo poi nei banche del supermercato.   Esistono altri casi semplici, come ad esempio molte fermentazioni utilizzate nell’industria agro-alimentare, dove spesso non c’è un momento preciso che segna il passaggio tra la fase vegetativa e quella produttiva, ovvero l’operatore non cambia intenzionalmente le condizioni ambientali, ma lascia per così dire che la popolazione di microrganismi termini tutto il nutrimento disponibile o quasi (es. gli zuccheri del mosto), fino ad una sorta di auto-spegnimento della fermentazione.

piccolo bioreattore sperimentale di laboratorio per la messa a punto della condizioni di processoNel caso di fermentazioni con finalità biosintetiche o di biotrasformazione, tuttavia, l’operatore decide sulla base delle analisi chimiche e microbiologiche quando è il momento giusto per modificare le condizioni ambientali e quindi indurre la biomassa al massimo della sua crescita, ad effettuare le trasformazioni desiderate.
Come e forse ancor più che per la messa a punto delle condizioni ottimali per lo sviluppo vegetativo, diventa fondamentale a questo punto avere a disposizione informazioni accurate relative al comportamento ed alle richieste dello specifico microrganismo utilizzato, informazioni che devono essere ricavate, ben prima dell’avvio della fase industriale della produzione, per mezzo di piccoli bioreattori sperimentali da laboratorio (come quello in figura), solitamente in vetro o anch’essi in acciaio, dalla dimensioni veramente minime (pochi litri o anche meno) ma dotati spesso delle stesse possibilità di controllo ed automazione di quelli industriali.   Esistono centri di ricerca per lo sviluppo ed il batteria di piccoli bioreattori sperimentali in un laboratorio di ricercamiglioramento non soltanto delle condizioni di processo relative a crescita e produzione, ma del microrganismo stesso attraverso operazioni di selezione, modifica genetica e sperimentazione applicativa, che dispongono di ampie batterie di piccoli fermentatori sperimentali, come quello riportato nell’eloquente immagine a lato.

Spesso le condizioni da adottare non sono esattamente quelle preferite per la crescita dello stesso microrganismo, anzi, in molti casi risulta necessario introdurre in esso situazioni di stimolo, di stress, di necessità, di contingenza.   Molti enzimi necessari per effettuare queste trasformazioni, per quanto codificati geneticamente, sono infatti prodotti in modo apprezzabile solo in condizioni di reale necessità, ad esempio quando le condizioni ambientali si fanno critiche per la sopravvivenza, oppure quando viene a mancare la fonte di nutrimento favorita e il microrganismo deve accontentarsi di un’altra fonte, quella che gli forniamo noi allo scopo di far effettuare su di essa la trasformazione voluta.

brodo di fermentazione a termine processo, prima e dopo la filtrazione della biomassa

brodo di fermentazione a termine processo, prima e dopo la filtrazione della biomassa

 

In altri casi riduciamo volontariamente la concentrazione di ossigeno, in altri si varia il pH anche oltre i limiti consigliati per una crescita sana e vigorosa, in altri si introduce una molecola estranea, non utile per la vita del microrganismo e talvolta persino fastidiosa, tanto fastidiosa che su di esso eseguirà delle reazioni chimiche allo scopo di ridurne l’impatto, in linea con l’esempio precedentemente richiamato dell’ostrica con il granello di sale.

Quando si vuole fare produrre qualcosa ai microrganismi che non sia semplicemente la loro stessa biomassa, a seconda dei casi (tipo di sostanza e di specie) la sostanza stessa può essere escreta nel brodo di coltura, dal quale può essere recuperata (insieme a tutti gli altri soluti) filtrando via la biomassa, oppure può rimanere racchiusa all’interno della cellula dello stesso microrganismo, dal quale può essere recuperata (insieme a tutti gli altri metaboliti cellulari) solo previa rottura della cellula con mezzi chimici, fisici o meccanici quali ultrasuoni, calore, pressione, ecc.


IN CONCLUSIONE

In conclusione, la gestione dei processi di biotrasformazione microbiologica non risulta troppo dissimile dalla gestione di un processo di sintesi o comunque di trasformazione chimica.   La conduzione di un fermentatore, sia esso in scala pilota oppure di grandi dimensioni utilizzato per finalità produttive, presenta diverse analogie con la conduzione di un reattore dove uno o più reagenti, in determinate condizioni ambientali (es. temperatura, pressione, pH) ed eventualmente in presenza di catalizzatori sono trasformate in uno o più prodotti, magari con la co-generazione più o meno controllabile di sottoprodotti indesiderati.

bioreattore industriale per funzionamento a batchIl microrganismo in una biotrasformazione, forte anche del suo corredo enzimatico che rende ancora più forte la metafora fino a farla diventare pura realtà, può essere assimilato al catalizzatore necessario per rendere possibile, o meglio rapida, una reazione organica, abbassandone l’energia di attivazione.
Nel suo insieme un fermentatore può quindi essere visto a tutti gli effetti, ed anche sul piano etimologico,  come un “bio-reattore” nel quale si introducono dei reagenti (substrato nutritivo, sali minerali ed altri fattori di crescita, eventuale ossigeno o anidride carbonica, l’eventuale substrato da trasformare), dei catalizzatori (inoculo del microrganismo) e dei media (acqua, tamponi, ecc), e si ottengono da esso prodotti utili e sottoprodotti, che solitamente vengono separati fra loro nelle fasi successive alla fermentazione mediante procedimenti di natura effettivamente chimica.

Al pari di un reattore chimico tradizionale, anche un bioreattore, almeno in linea di principio, può funzionare in modo discontinuo oppure in modo continuo.
L’impiego discontinuo, detto anche a batch, è quello classico descritto finora: si sterilizza, si riempie il fermentatore con il terreno di coltura anch’esso sterilizzato, si inocula il microrganismo, lo si fa crescere controllando e se il caso modificando in continuo le condizioni ambientali, dopo una fase di sviluppo vegetativo si modificano eventualmente e condizioni ambientali e si introducono ulteriori componenti, e ad un certo punto, a trasformazione avvenuta in modo accettabile, si scarica il tutto, si uccidono i microrganismi e di estrae da essi o dal loro brodo di coltura le sostanze d’interesse.
bioreattore industriale con funzionamento continuoIn un bioreattore continuo, invece, continuamente vengono aggiunti i nutrienti e le altre sostanze richieste per la crescita e l’attività del microrganismo, e continuamente viene prelevata sia biomassa brodo: il tutto viene idealmente rappresentato come un cilindro molto allungato, dove ad un estremo si aggiunge, ed all’altro estremo si toglie, continuativamente, qualcosa.      Se in un reattore chimico tradizionale, i cui processi di trasformazione per quanto lunghi raramente raggiungono il numero di giorni richiesto per la maggior parte delle biotrasformazioni, si parla spesso di “flusso a pistone”, per intendere il fatto che, anche in assenza ideale di mescolamento, i materiali in ingresso inducono un movimento longitudinale, ovvero “spingono” la massa di reazione lungo il cilindro, tanto che a metà della sua lunghezza troveremmo probabilmente i regenti misti ai prodotti, ed in uscita dal reattore, ovvero sull’estremità opposta, potremo trovare idealmente solo i prodotti.
In un bioreattore in continuo la situazione è ancora più complessa in quanto i tempi lunghi di trasformazione e la necessità di mescolamento, impediscono di rispettare la divisione concettuale fra ingresso dei reattivi ed uscita dei prodotti: si giungerà per tanto ad un compromesso statistico, dove nel prodotto prelevato in continuo sarà presente anche una parte consistente nei nutrienti e delle sostanze introdotte, non trasformate, in miscela con i prodotti della biotrasformazione ed insieme ad una quota all’incirca costante di biomassa, di entità pari al tasso di moltiplicazione valutato.

In un’ottica di recupero massimizzato di materia, oltre che di energia, la biomassa filtrata ed essiccata viene in molti casi riutilizzata come fonte energetica, previa stabilizzazione chimico-biologica, alimentando un impianto di termovalorizzazione in grado di fornire l’energia termica o addirittura elettrica necessaria al mantenimento dell’intero processo. In un processo di trasformazione microbiologica di questo tipo, almeno sul piano ideale, l’energia al sistema sarà fornita essenzialmente della fonte di carbonio utilizzata in funzione di alimento, ad esempio dai carboidrati in soluzione che costituiscono l’alimento privilegiato per la maggior parte dei microrganismi.


FERMENTAZIONI E BIOTRASFORMAZIONI MICROBIOLOGICHE

Dal punto di vista biochimico, una fermentazione è uno dei possibili processi metabolici che si collocano nell’ambito del metabolismo energetico di un organismo ed è finalizzato per tanto alla produzione dell’energia richiesta alla sopravvivenza dell’organismo medesimo (circa il metabolismo energetico di veda anche l’intervento “Perché mangiamo? Le ragioni dell’alimentazione, dal punto di vista chimico”.
schema di metabolismo energetico di tipo respiratorioLa fermentazione propriamente detta è per tanto da intendersi un processo metabolico alternativo, parallelo o più spesso concorrenziale rispetto alla via maggiormente conosciuta nell’ambito del metabolismo energetico, ovvero alla respirazione cellulare, con una “piccola” differenza, che comporterà come vedremo delle conseguenze davvero radicali negli esiti finali ed applicativi dell’intero processo.
Nella respirazione cellulare (quella aerobia o anaerobia che sia), infatti, l’accettazione finale degli elettroni alla fine della catena di trasporto (es. fosforilazione ossidativa) risulta essere una specie chimica preposta allo scopo, l’ossigeno nella respirazione aerobia, generalmente uno ione inorganico come ad esempio il nitrato o il solfato in quella anaerobia.
In una fermentazione, invece, l’accettazione finale di questa coppia di elettroni ormai “scarica” viene effettuata da una specie organica, ed in particolare da parte della stessa specie chimica che viene ossidata a scopo di produzione energetica.  In altre parole, partendo da una molecola organica utilizzata dal microrganismo come fonte energetica, ad esempio da un carboidrato come il glucosio, parte di questo sarà ossidato (con produzione dei classici intermedi trasportatori di energia come l’ATP), mentre una quantità stechiometricamente equivalente di glucosio sarà ridotta dai due elettroni scaricati, fino a formare ad esempio etanolo (alcol etilico) o altre sostanze chimiche dove lo stato di ossidazione del carbonio risulterà ulteriormente ridotto rispetto a quello del substrato zuccherino di partenza.

A scopo esemplificativo riportiamo di seguito uno schema biochimico di due dei più importanti professi di fermentazione: quella alcolica, che partendo da una molecola di glucosio consente di arrivare alla sua traformazione in due molecole di etanolo (alcol etilico) ed alla produzione di due molecole di ATP, con sottoprodotto rappresentato da due molecole di anidride carbonica (le bollicine di birra e spumante),

schema di fermentazione alcolica - da glucosio a piruvato (tramite glicolisi) ad acetaldeidie ad ad etanolo

e quella lattica, tipica dell’inacidimento del latte, sfruttata per esempio nella produzione dello yogurt, che vede la conversione di due molecole di glucosio in due molecole di acido lattico, oltre alla fosforilazione di due molecole di ADP in due di ATP, che costituisce la ragione d’essere dell’intero processo nell’ambito del metabolismo energetico.

schema fermentazione lattica - da glucosio ad acido lattico
In entrambi i casi il cuore del processo sta in quel circolino chiuso su sé stesso, dove si assiste alla conversione di NAD+ in NADH (riduzione, grazie all’assunzione di 2 elettronici accompagnati da due idrogenioni H+) a carico del glucosio o della fonte energetica generalmente costituita da un carboidrato, che viene in questo modo ossidato.   Il ritorno del circolino al punto di partenza è rappresentato dalla successiva riconversione di questo NADH nel NAD+ di partenza (ossidazione), previa riduzione di un metabolica intermedio derivante a sua volta dal glucosio (acetaldeide per la fermentazione alcolica, acido piruvico per la fermentazione lattica).    Il glucosio viene in questo modo almeno in parte ridotto (uno o più di uno dei suoi atomi di carbonio riduce il suo numero di ossidazione) ed acquisisce gli idrogenioni H+ impartiti ad esso dal NADH.

La fermentazione può essere considerata una variante, chiedo scusa dell’espressione, per “tagliare corto” un processo di respirazione cellulare, che altrimenti risulterebbe sicuramente più lungo e complesso, anche se certamente a maggior rendimento energetico. Le freccine che in questi due schemi semplificati portano dal glucosio all’acido piruvico infatti sono in comune con la respirazione e vanno sotto il nome di “glicolisi”, ma nel caso della respirazione l’acido piruvico diventa il punto di partenza di altri cicli, prima attraverso la sintesi dell’acetil coenzima A, poi da questo in direzione del ciclo di Krebs (detto anche ciclo degli acidi tricabossilici) e da questo alla catena della fosforilazione ossidativi.
strutture molecolari NAD+ (forma ossidata) e NADH (forma ridotta)Una maggiore efficienza, quella del processo di respirazione nel suo insieme (più occasioni di sintesi di altro ATP anche negli stadi successivi di reazione), che richiede tempo per essere svolta nel suo insieme, richiede un bel corredo di enzimi e di ultrastrutture cellulari idonee per il suo svolgimento, che deve essere opportunamente codificata geneticamente (e non tutti i microrganismi prevedono geneticamente tutto questo) e, soprattutto, prevede la presenza di ossigeno, quello atmosferico, trasportato in un modo o nell’altro fino all’interno della cellula, quale ossidante finale, o accettore di elettroni che di si voglia.   Il ruolo che in una fermentazione è svolto altrettanto bene da una parte dello stesso glucosio, o di un’altra molecola organica che viene però sottratta in larga misura dal suo sfruttamento energetico diretto finalizzato alla produzione di ATP.   Lo stesso NADH è in questo caso “sprecato” a forza, per poter rigenerare il NAD+ di partenza, impedendo il recupero energetico che sarebbe altrimenti possibile, nelle fasi successive della respirazione, anche da questa molecola.
Proprio per questi due destini stechiometricamente equivalenti, ma in direzione opposta nel contesto ossido-riduttivo, i processi di fermentazione propriamente detti possono essere considerati nel loro insieme come reazioni di di sproporzione o dismutazione.

Si riconoscono numerosi processi di fermentazione diffusi in natura e sfruttati tecnologicamente dall’uomo, quali: fermentazione alcolica, fermentazione acetica, fermentazione malo-mattica, fermentazione propionica, fermentazione lattica, fermentazione omolattica, fermentazione a butilenglicole, ecc che si distinguono fra loro, come è facilmente intuibile dal nome, soprattutto in relazione alla natura chimica dei prodotti finali, ovvero della natura chimica della specie dove il carbonio è stato ridotto.
Circa l’applicazione del concetto di ossidazione e riduzione sulle molecole organiche, ed in particolare sul numero ossidazione formalmente assegnabile agli atomi di carbonio in queste molecole, si suggerisce l’articolo “La chimica a colori: dall’ossidazione delle molecole alle interazioni luce-materia”.

2 risposte a microrganismi in cattività: quando la sintesi chimica ricorre al bioreattore

  • vittorio bonaccorsi scrive:

    per favore vorrei conoscere il miglior metodo di filtrazione su scala
    semi industriale ( batch di 1000 litri alla volta ) per recuperare tutta la biomassa senza dannegiare la vitalita’ dei fermenti.

  • julia scrive:

    kuesta pagina mi e stata molto utile x un lavoro di scienza q ci a mandato una prof.grazie al creatore

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