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Le tecniche per analizzare le possibili alterazioni molecolari degli acidi nucleici (parte II)

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di Sergio Barocci

Altre tecniche sviluppate sulla scia della PCR

Sempre a partire dagli anni ’90 la tecnica della PCR viene ancora più perfezionata e automatizzata (termociclatori) al punto da sostituire molte tecniche di clonaggio tradizionale e nello stesso tempo trovano applicazione e si sviluppano altri metodi alternativi o complementari nella ricerca di base, nella diagnostica molecolare e nell’ ambito forense. Si tratta di :

1. metodi di amplificazione del “target”
2. metodi di amplificazione del segnale

termociclatoreEsempio di Thermal cycler o Termociclatore: si tratta di uno strumento di laboratorio in grado di condurre automaticamente determinate variazioni cicliche di temperatura necessarie all’amplificazione enzimatica di sequenze di DNA in vitro attraverso la PCR. E’ costituito da un blocco termico per alloggiare i campioni da amplificare , in genere contenuti in provette tipo eppendorf e da un sistema in grado di aumentare o ridurre la temperatura del blocco in base alle istruzioni fornite da un programma di amplificazione . Alcuni di questi modelli sono in grado di effettuare gradienti termici all’interno del blocco termico, nel caso di utilizzazione di temperature di annealing differenti per una determinata coppia di primer. I dispositivi più moderni sono dotati di un coperchio riscaldato che, premendo sui tappi delle provette eppendorf , impedisce la formazione di condensa nella parte superiore dei tubi di reazione. I termociclatori sono in genere dotati di una tastiera e da un display a cristalli liquidi utilizzati per immettere i programmi nella memoria della macchina.

Amplificazione del target

Nested PCR

La nested PCR è una variante della tecnica di PCR, utilizzata per aumentare la specificità dell’amplificazione, che prevede due distinte e successive reazioni di amplificazione:

1. Nella prima amplificazione (prima PCR) si utilizza una coppia di primers più esterni al frammento di DNA da amplificare.

2. Nella seconda amplificazione ( seconda PCR) si utilizza una coppia di primers che amplificano un frammento interno a quello amplificato nella prima reazione. In pratica, una frazione del prodotto amplificato nella prima PCR viene trasferito in una seconda provetta contenente una nuova miscela di reazione, uguale alla precedente per tutti i componenti ad eccezione dei primers. Il target dell’amplificazione è presente in condizioni completamente diverse nelle due reazioni di PCR. Infatti, nella prima ci sono poche copie di sequenza bersaglio in un “background” di DNA complesso e abbondante mentre nella seconda PCR il numero di sequenze bersaglio è maggiore e il “background” è significativamente ridotto.
Si tratta, quindi, di una modifica della PCR tradizionale destinata a ridurre o a eliminare eventuali prodotti aspecifici non desiderati in seguito all’amplificazione di siti di legame di primer inaspettati ( primers che possono legarsi a regioni di DNA non corrette) .
In questo modo, si viene ad aumentare la resa e la specificità di PCR particolarmente difficili.

Nested PCR - esempio

Nested PCR – esempio

Miglioramento della sensibilità.

Se il prodotto di amplificazione fosse aspecifico la seconda PCR non andrebbe a buon fine. Questa tecnica, trova però sempre minore applicazione in ragione degli alti rischi di contaminazione tra i diversi campioni per il fatto che le provette contenenti i prodotti di amplificazione devono necessariamente essere manipolate nella stessa area in cui sono presenti le miscele della seconda reazione.
Per ridurre questo rischio si consiglia di minimizzare il numero di cicli della prima PCR. Inoltre, nella seconda reazione viene prodotta una quantità elevata di frammenti bersaglio che rappresenta la più pericolosa fonte di contaminazione di “carry – over”.

amplificazione di un target specifico di DNA

meccanismo della Nested PCR

meccanismo della Nested PCR


Reverse transcriptase PCR (RT–PCR)

La tecnica della RT- PCR è un ‘altra variante della tecnica della PCR o reazione a catena della polimerasi. Si tratta di una tecnica di amplificazione genica sviluppata per rilevare ed analizzare l’RNA presente nel campione in esame. L’RNA target viene inizialmente convertito in c DNA ( DNA a singola elica) ad opera di un enzima, la trascrittasi inversa o RT . Questo enzima è una DNA polimerasi RNA dipendente, inizialmente identificata nei retrovirus ( un gruppo di virus che utilizza la trascrittasi inversa per convertire il proprio genoma da RNA a DNA durante il proprio ciclo di replicazione) . Non è termoresistente ( è attiva 37-42°C).
Sono state anche isolate e clonate delle RT mutanti che resistono a temperatura fino a 60°C per aumentare specificità. Il prodotto della reazione è un prodotto ibrido RNA/DNA. Dopo allontanamento dell’RNA, il cDNA può essere utilizzato come templato per l’amplificazione enzimatica (PCR)
In pratica , con questa tecnica si utilizza l’RNA come stampo per la PCR. Il primo step è la conversione dell’RNA in DNA complementare a singolo filamento (cDNA) attraverso la trascrittasi inversa. In seguito, grazie alla presenza dei primer e della Taq polimerasi, si procede con la classica reazione di PCR. Come già riferito sopra, esistono alcune polimerasi termostabili con attività di trascrittasi inversa e di DNA polimerasi DNA-dipendente (capaci di copiare sia l’RNA sia il DNA) in modo da eseguire tutti i passaggi dell’RT-PCR in una singola reazione.
Quindi, la RT-PCR è la reazione con la quale si amplificano copie in cDNA dell’RNA . E’ rapida e versatile e permette di ottenere e clonare tratti di RNA desiderati o addirittura di generare “cDNA libraries”.

schema di reazioni della Reverse Transcriptase PCR

schema di reazioni della Reverse Transcriptase PCR

Viene largamente impiegata per valutare l’espressione genica tramite il contenuto di mRNA per il gene in esame. E’ anche possibile con alcuni adattamenti identificare mutazioni o polimorfismi con RT-PCR e prodotte anche diverse varianti. Il primo passaggio della reazione è quindi la conversione di mRNA in cDNA stampo a singolo filamento. In questo specifico caso un oligodesossinucleotide (primer) è ibridizzato all’RNA e poi esteso come filamento singolo da una DNA polimerasi RNA – dipendente.

antisense oligonucleotidi

antisense oligonucleotidi

Questa copia in cDNA dell’RNA risulterà poi lo stampo per la successiva amplificazione. A seconda di quanto si desidera individuare, il primer da cui inizia la sintesi del cDNA può legarsi ad uno specifico gene di interesse o da tutti gli mRNA. Si possono utilizzare diversi tipi di primers :
1. Gli oligo(dT) si legano alle code di poly(A) in 3’ all’mRNA e generano filamenti più o meno lunghi. Sono particolarmente indicati quando la sequenza di interesse è in 3’ del gene;
2. Gli oligonucleotidi “antisense specifici” sono dei primers disegnati sulla sequenza di un certo gene dove si vanno ad ibridizzare dando come prodotto la copia in cDNA del solo gene di interesse. La successiva amplificazione fornisce poi il gene atteso. Quando si usano primers specifici è preferibile amplificare successivamente il prodotto con un altro primer che si trovi in un esone differente in modo da evitare di amplificare le copie genomiche presenti come contaminanti . Se ciò non fosse possibile è preferibile digerire preventivamente il campione di RNA da retrotrascrivere con “DNAsi – RNAsi free” . In questo modo si purifica l’RNA dalla porzione contaminante di DNA genomico.
3. I “random hexanucleotides” o “esameri random” sono invece dei primers con sequenze apposite che si legano casualmente in diverse regioni dell’RNA generando brevi tratti di cDNA e copie frammentarie di molecole di RNA . Risultano molto utili quando l’RNA bersaglio è molto lungo o contiene strutture secondarie che ne rendono impossibile la retro trascrizione completa.
In generale, per ottenere cDNA lunghi , i primers più indicati sono quelli antisenso specifici seguiti poi dagli oligo (dT) e in ultimo, dagli esameri random

 

Metodo di preparazione dell’ RNA

a) contaminazione del campione di RNA con DNA genomico
• La PCR non è in grado di discriminare fra cDNA e DNA genomico.
• E’ opportuno trattare il campione con DNasi (da inattivare dopo 30 min ) prima di utilizzarlo in RT-PCR.
• Un ulteriore controllo consiste nell’effettuare un’amplificazione del campione senza retrotrascriverlo.
• L’uso di RNA arricchito in mRNA utilizzando colonne oligodT migliora la purezza del campione.
• Un ulteriore accorgimento è quello di scegliere come primer per la retro trascrizione l’oligodT e come primer per l’amplificazione oligo posizionati su due esoni diversi (pseudogeni spesso intronless e con code di poliA possono comunque essere amplificati).

esempio di mRNA - struttura molecolare secondo due diverse prospettive

esempio di mRNA – struttura molecolare secondo due diverse prospettive

b) problema della degradazione dell’RNA
• Usare materiale decontaminato da RNAsi
• Preparazioni da materiale fresco, uso di sostanze stabilizzanti (tipo RNAlater).
Per ottenere full lenght cDNA il problema della degradazione è molto importante, mentre per amplificare ampliconi piccoli si può tollerare un certo grado di degradazione.
c) metodo di purificazione
Si può utilizzare RNA totale o RNA citoplasmatico o poly(A)+RNA a seconda del target

Disegno dei primer specifici
• Secondo le regole di PCR

Sintesi del primo strand del cDNA con il primer più adatto
Possono essere usati a tale scopo primer diversi in funzione di ciò che si vuole ottenere :
1. oligodT : amplifica a partire dal poliA , cDNA completo
2. primer specifici : amplifica a partire dal sito del primer reverse, frammento desiderato/CDS completa
3. esanucleotidi random: amplifica un po’ tutto il mRNA ma a pezzi cDNA non completo/utile nella RT-PCR quantitativa

Amplificazione enzimatica
Si utilizza l’enzima trascrittasi inversa per trasformare la sequenza di RNA in cDNA ; questa reazione è seguita da una PCR per amplificare il cDNA. Necessario, quindi, valutare la scelta dell’enzima retrotrascrittasi e disegnare un protocollo di amplificazione adatti ai propri scopi.

 

Le trascrittasi inverse

 

Esistono diverse trascrittasi inverse utilizzate in biologia molecolare:

  • Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV-RT)
  • Avian Myleoblastosis Virus AMV
  • Tth DNA polimerasi ecc.
struttura molecolare di una DNA polimerasi

struttura molecolare di una DNA polimerasi

Struttura della DNA polimerasi (RNA-dipendente) o trascrittasi inversa . Si tratta di un enzima appartenente alla classe delle transferasi che sintetizza DNA come le DNA polimerasi ma con la differenza rispetto a queste ultime di utilizzare anche RNA come stampo di partenza. E’ l’enzima caratteristico della famiglia dei retrovirus che usano RNA come materiale genetico.

La trascrittasi inversa, utilizzata per il clonaggio di cDNA e per la tecnica di RT-PCR , ha tre attività essenziali per la replicazione virale:

  • DNA-sintetasi RNA-dipendente, che sintetizza in direzione 5’→3′ una catena di DNA a partire dallo stampo di RNA virale ( viene sfruttata in laboratorio per retrotrascrivere molecole di RNA, essenzialmente mRN o RNA messaggero, in DNA complementare;
  • RNAsi-H, che elimina i filamenti ibridi di DNA-RNA mediante la demolizione dei ribonucleotidi, e dunque dell’RNA cioè in poche parole degrada gli ibridi DNA-RNA che si formano durante la retrotrascrizione;
  • DNA-sintetasi DNA-dipendente che completa il doppio filamento di DNA a partire dal DNA neosintetizzato;
schema della RT-PCR

schema della RT-PCR

Le tre attività della trascrittasi inversa permettono il completamento di una catena doppia di DNA a partire da un singolo filamento di RNA. Vista l’attività di trascrizione dell’RNA a DNA questo enzima prende anche il nome caratteristico di trascrittasi inversa per marcare il fatto che, normalmente, le DNA polimerasi catalizzano la trascrizione del DNA in RNA.

 

 

Multiplex PCR

La Multiplex PCR è una reazione di amplificazione in cui una o più coppie di “primers” specifici per differenti “target”, vengono introdotte nello stesso tubo di reazione, permettendo l’amplificazione di molteplici sequenze. Si tratta di una modifica della normale PCR per individuare rapidamente delezioni o duplicazioni in un grande gene Infatti, è stata descritta nel 1988 come metodologia per la rilevazione di alcune delezioni cromosomiche nel gene distrofina e a a partire dal 2008 anche utilizzata per l’analisi di micro satelliti (SRT o short tandem repeats cioè sequenze ripetute di DNA non codificante, costituiti da unità di ripetizione molto corte 1-5 bp e disposte secondo una ripetizione in tandem, utilizzabili come marcatori molecolari di loci genetici ) e SNPs o polimorfismo a singolo nucleotide cioè variazione di materiale genico a carico di un unico nucleotide. La Multiplex–PCR è’ costituita, come già detto, da più set di primer in un unico mix PCR per produrre ampliconi o prodotti di amplificazione di varie dimensioni che sono specifici per diverse sequenze di DNA target. Prendendo diversi geni in un solo ciclo di PCR, si possono acquisire le informazioni necessarie da una singolo test invece che dall’uso di più reagenti e di più tempo richiesti per l’esecuzione. Tutte le temperature di “annealing” per ciascun set di primer possono essere ottimizzate per operare in maniera corretta in un unico reazione. Oggi, sono disponibili diversi kit per effettuare la PCR multiplex , specialmente utili nei laboratori di polizia scientifica allo scopo di amplificare campioni di DNA degradati.
Strategia

Due coppie di sonde di ibridazione, ciascuna specifica per un prodotto di amplificazione, vengono marcate con un diverso colorante accettore che emette la fluorescenza a differenti lunghezze d’onda. Il segnale emesso viene letto simultaneamente attraverso due canali di rilevamento fluorimetrico.

Multiplex PCR

Multiplex PCR

Hot start PCR

La Hot Start PCR è una forma modificata di PCR che riduce l’amplificazione non specifica.
Perché realizzare una PCR “ Hot- Start”?
a) durante l’allestimento della reazione di PCR o durante il riscaldamento iniziale del campione si possono verificare situazioni di appaiamento non specifico tra primers e stampo (formazione di dimeri di primer);
b) tra la temperatura di 40°C e 50°C la Taq polimerasi ha una efficiente attività polimerasica e può estendere i primers non correttamente appaiati,
Quindi, la Hot-Start PCR previene la formazione di questi prodotti non specifici e spesso, aumenta le rese di prodotto

Long PCR

La Long PCR è una reazione di PCR in grado di amplificare stampi di lunghezza superiore a quella comunemente raggiunta dalla Taq polimerasi (oltre 5 Kilobases o Kbp; spesso anche oltre 10 Kbp).
Con l’utilizzo di miscele di DNA polimerasi a processività superiori (tipo Vent, Miscele Taq + Pwo vendute già pronte, Tth DNA polimerasi) o di tamponi di reazione opportuni in cui vengono aggiunti additivi come dimetilsolfossido (DMSO) o la tricina, si riescono ad amplificare con alta efficienza frammenti di DNA lunghi sino a 30 Kbp.
Il protocollo di amplificazione della tecnica Long–PCR deve tener conto che la velocità di polimerizzazione è sempre all’incirca di 1 Kbp/minuto e che con il passar dei cicli di denaturazione la frazione di enzima attivo diminuisce , riducendo di conseguenza la velocità di polimerizzazione.

molecole del dimetilsolfossido (DMSO) e della tricina

molecole del dimetilsolfossido (DMSO) e della tricina

Touchdown – PCR

La Touchdown PCR o TD–PCR è una metodologia molto semplice e rapida per ottimizzare la PCR aumentando la specificità. Essa, impiega una temperatura di annealing o di appaiamento iniziale al di sopra della T melting o temperatura di fusione Tm (temperatura alla quale il 50% delle molecole di DNA sono denaturate e dipende .sia dalla lunghezza totale della molecola di DNA, sia dalla specifica sequenza dei nucleotidi) dei primers in uso, per poi essere gradualmente modificata nel corso di cicli successivi sino ad un valore inferiore alla Tm attesa . In questo modo si garantisce un appaiamento specifico dei primers alla loro corretta sequenza bersaglio, scoraggiando in questo caso un’ eventuale formazione di prodotti di amplificazione aspecifici.

Esistono vari metodi per calcolare i valori di Tm. che utilizzano alcune formule:

a) Metodo di Wallace–Ikatura
Si tratta di un metodo veloce ma meno accurato per stimare la temperatura di fusione Tm per primers di lunghezza fino a 20 nucleotidi. Sia attua contando la frequenza di ciascun tipo di nucleotide ( A,T,C,G) tenendo conto degli appaiamenti citosina-guanina (C-G) con tre legami idrogeno e degli appaiamenti adenina-timina (A-T) invece con due legami idrogeno e del fatto che le coppie C-G contribuiscono ad una maggiore stabilità della doppia elica

Tm = 2°C x (A + T) + 4°C x (G + C)

diagmamma della temperatura nella Touchdown PCR

diagmamma della temperatura nella Touchdown PCR

b) Metodo di Marmur–Schildkraut–Doty
E’ un metodo più accurato che può essere utilizzato per primers tra 15 e 70 nucleotidi La T melting è così calcolata : Tm = 81,5 + 16,6 (log [ i+] + 0,41 (% G + C) – (600 / N) dove i è la concentrazione molare dei cationi monovalenti e N è la lunghezza dell’ oligonucleotide.

c) Metodo di Wu
Utilizza la seguente formula valida per primers da 20 a 35 nucleotidi

T m = 22 + 1,46 [(2 x G + C) + (A + T)]

 

Voci bibliografiche

• Southern, E.M. “ Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis” . J Mol Biol. 1975, 98, 503.
• Alwine JC Kemp DJ, Stark GR. “Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl – paper and hybridization with DNA probes”, Proc Natl Acad Sci U S A., 1977, 74(12):5350
• Masato O, et al. “ Detection of the polymorphisms of human DNA by gelelectrophoresis as single-strand conformation polymorphisms “, Proc Natl Acad Sci USA 1989, 86, 2766- 70
• Nocera A, Barocci S, Gorski J. “ Transcription analysis of non-HLA genes within or flanking the class II region in a B-cell line from an HLA-SCID patient. Tissue Antigens. 1993 , 41(2), 94
• Primrose, SB. et al. Principles of gene manipulation. . 2001 Wiley-Blackwell.
• Don RH et al. “ Touchdown’ PCR to circumvent spurious priming during gene amplification” Nucleic Acids Res., 1991, 19(14), 4008
• Hayden MJ et al. “Multiplex-ready PCR: a new method for multiplexed SSR and SNP genotyping” BMC Genomics, 2008, 9, 80

 

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