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Le tecniche per analizzare le possibili alterazioni molecolari degli acidi nucleici (parte I)

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di Sergio Barocci

termociclatoreMolte delle tecniche utilizzate tra la fine degli anni ’70 e l’inizio degli anni ’80 prima cioè della scoperta della PCR erano poco standardizzate.  Presentavano grandi variabilità di efficienza tra i vari laboratori e i risultati ottenuti mostravano molte volte delle difformità.  In aggiunta l’esecuzione di queste tecniche richiedeva  spesso attrezzature e competenze che non erano facilmente disponibili nei vari laboratori diagnostici.
In quel periodo le tecnologie disponibili  per analizzare possibili alterazioni molecolari di acidi nucleici associate a patologie umane erano rappresentate soprattutto da tecniche quali il “Southern blot” e il “Northern blot”, rispettivamente per l’analisi del DNA e dell’RNA, la digestione enzimatica del DNA con gli enzimi di restrizione, il sequenziamento di frammenti di DNA,

Ad esempio, la metodica del “Southern blot”, messa a punto da E. Southern per la caratterizzazione sia di DNA genomico che di DNA clonato, richiedeva l’estrazione di un certo quantitativo in microgrammi (µg) di DNA da campioni biologici come cellule eucariotiche o procariotiche, tessuti o ancora fluidi biologici che non doveva essere degradato, cioè che doveva conservare la struttura complessa del DNA di partenza.

Sir Edwin Mellor Southern

Sir Edwin Mellor Southern

Successivamente, fu necessaria una fase di digestione del DNA mediante trattamento con enzimi di restrizione cioè quegli enzimi  in grado di tagliare il DNA all’altezza di sequenze nucleotidiche ben definite.  Il DNA così modificato poteva essere poi  sottoposto a separazione mediante migrazione in campo elettroforetico e in seguito  trasferito per capillarità (“blotting”), su una membrana di nylon o di nitrocellulosa, fissato su questa membrana e fatto reagire con una sequenza complementare di DNA denominata “probe” marcata, in genere con un isotopo radioattivo o chimicamente con biotina.
Dopo aver fatto ibridare il DNA, in condizioni opportune che facilitavano  un’alta specificità di ibridazione (“annealing”), si effettuava  una rivelazione della eventuale reazione di ibridazione mediante autogradiografia.  Questa  tecnologia pur essendo un potente metodo di indagine molecolare presentava diversi svantaggi (ricorso alla digestione con enzimi di restrizione, utilizzo di sonde radioattive o biotinilate, tempi lunghi di esecuzione)

 

Procedura del Southern Blotting

Si tratta di una tecnica  mediante  la quale si può osservare la presenza o l’assenza di specifici frammenti genici.  Il metodo per operare il Southern blotting è articolato e garantisce buoni margini di qualità.
Le sue fasi  sono le seguenti:
• estrarre il DNA che si vuole saggiare;
• processare il DNA con enzimi di restrizione specifici (es. EcoRI, HindIII, etc.);
• operare una elettroforesi in gel di agarosio grazie alla quale  è possibile separare, spazialmente, i segmenti di DNA grazie alla loro massa;
• denaturare il DNA usando un tampone alcalino come l’urea o, comunque, una soluzione alcalina;
• trasferire  il DNA dal gel di agarosio ad una membrana di nylon o di cellulosa;
• incubare con una sonda specifica per il  DNA da analizzare;
• rilevare, mediante un opportuno rivelatore, la presenza di bande che stanno a significare che la sequenza bersaglio è stata raggiunta dalla sonda.

procedura del Southern Blotting

procedura del Southern Blotting

Tale tecnica è  risultata utile in passato specialmente per identificare una particolare sequenza genica (conosciuta) in un campione di DNA ma anche per essere stata in grado di rivelare la presenza di specifiche sequenze di DNA in miscele complesse.

Allo stesso modo le molecole di RNA si possono separare per mezzo di  elettroforesi su gel e sequenze specifiche si possono identificare mediante ibridizzazione dopo trasferimento su nitrocellulosa.  La tecnica per l’analisi dell’RNA, analoga al Southern Blotting, è stata chiamata Northern Blotting (inventata nel 1977 da James Alwine, David Kemp e George Stark dell’Università di Stanford) mentre il Western Blotting si riferisce ad una tecnica che permette di identificare invece una proteina particolare tramite un anticorpo specifico.

Università di Stanford – Palo Alto, California

Università di Stanford – Palo Alto, California

La tecnica del “Southern Blotting” permette di individuare un DNA di interesse mediante elettroforesi su gel ed ibridazione con una sonda marcata. Il DNA viene denaturato mediante un tampone a pH  basico e trasferito su un foglio di nitrocellulosa o nylon poi il DNA su un foglio di nitrocellulosa o nylon viene ibridato con una sonda marcata e identificato mediante autoradiografia.   I metodi di trasferimento possono essere di due tipi :   a) capillare;    b) elettroblot

trasferimento capillare e per elettroblotting del DNA denaturato

 

Procedura  del Northern Blotting

i tre ricercatori statunitensi che misero a punto il sistema del Northern Blotting: da sin. a des. David Kemp, James Alwine, George Stark

i tre ricercatori statunitensi che misero a punto il sistema del Northern Blotting: da sin. a des. David Kemp, James Alwine, George Stark

Il  Northern blotting   è una tecnica che permette il rilevamento di sequenze di RNA utilizzando delle sonde molecolari. L’RNA è frazionato in un gel d’agarosio e trasferito su una membrana, che viene messa a contatto con delle sonde marcate (di RNA complementare o di DNA a singolo filamento).  Il legame della sonda alla membrana, mediante la  formazione di legami idrogeno, può essere rilevato mediante autoradiografia.  La sonda radioattiva formerà sulla  membrana una banda nella posizione corrispondente alle sequenze complementari della sonda.

procedura generale del Northern Blotting per l'RNA

procedura generale del Northern Blotting per l’RNA

 

La biologia molecolare a partire dagli anni ‘80

La rivoluzione della biologia molecolare avviene  intorno alla metà degli anni’ 80  con la scoperta della reazione a catena della polimerasi (PCR) (Kary Mullis nel 1983 e Premio Nobel per la chimica nel 1993) e in seguito nel 1988  con una  polimerasi termostabile (Taq DNA polimerasi) ottenuta a partire dal  batterio termoresistente Thermus acquaticus che ha posto le basi per una  innovazione tecnologica di grande rilevo.
L’utilizzo  di questa DNA  polimerasi ha consentito di effettuare la fase di estensione  della PCR  a 72 °C aumentando la resa e la specificità dei prodotti di reazione e in particolar modo  ha reso possibile l’automazione del processo.
Esistono oggi numerose varianti della Taq polimerasi, incluse polimerasi isolate da Thermus flavus (Tfl polimerasi), Thermus thermophilus (Tth polimerasi) e Pyrococcus woesei (Pwo).
Le caratterististiche più importanti delle polimerasi di questo tipo sono rappresentate dalla termostabilità, dalla la processività (affinità per lo stampo che determina il numero di base incorporate prima della dissociazione) e dalla fedeltà di incorporazione.
Fedeltà di sintesi della Taq polimerasi o High Fidelity

Un aspetto di particolare importanza è costituito dalla fedeltà di incorporazione.  In generale le DNA polimerasi duplicano il DNA fedelmente, ma non esattamente, con un tasso d’errore intorno a 10-9. Questa bassa frequenza di errore è mantenuta grazie alla presenza di attività di correzione di bozze (proofreading).  La Taq polimerasi, tuttavia, è priva di attività proof reading ed incorpora, in media, una base sbagliata ogni  20000 sintetizzate (2 x 10-4). Anche se questa caratteristica non è rilevante nelle tecniche analitiche può risultare  un grosso problema nei clonaggi. Esistono in commercio DNA polimerasi termostabili con attività di proof reading con tassi di errore più bassi, fino a 1.6 x 10– 6, che andrebbero usati nei clonaggi molecolari.
La scoperta della PCR ha, pertanto, rappresentato la seconda rivoluzione nelle tecniche di manipolazione del DNA e il suo grande successo  è  dipeso  dal  fatto che   ha consentito  non solo di  amplificare il DNA partendo da quantitativi  di  questo acido nucleico  molto ridotti, dell’ordine di grandezza dei  nanogrammi  ma soprattutto di ottenere  rapidamente milioni  di molecole di DNA identiche a quelle del  DNA di partenza.
Un altro vantaggio di questa tecnologia,  rispetto ad altri metodi di diagnosi a livello molecolare, è rappresentato anche dalla possibilità di amplificare segmenti molto piccoli di DNA e parzialmente degradati. Anche  materiale biologico non purificato può funzionare da stampo per il primo ciclo di amplificazione.  Inoltre, è anche  possibile eseguire questo tipo di indagine  sia partendo da campioni bioptici freschi, quali ad esempio cellule mononucleate del sangue (linfociti), siero, fluidi biologici vari (saliva, urina, liquor, ecc) sia da campioni utilizzati per scopi istologici come fettine di tessuto incluse in paraffina.

Pyrococcus furiosus

Pyrococcus furiosus

Infatti, le potenzialità della PCR  sono sempre di più  aumentate negli anni successivi anche attraverso l’identificazione e la commercializzazione di  prodotti  biotecnologici (altre DNA polimerasi  termostabili come Pwo, Pfu isolate da Archea o Archeobatteri  del genere Pyrococcus e Pfx  da Thermococcus) che hanno permesso  di superare i limiti di attività della Taq DNA polimerasi (ricavata dal batterio termofilo Thermus aquaticus)  con l’aggiunta della capacità  del  proof-reading o “correzione delle bozze”  cioè  della capacità  della DNA polimerasi di “leggere e correggere” la sequenza di acido nucleico “stampata”, tramite cui è possibile  eliminare un nucleotide che non sia appaiato nella giusta maniera durante l’amplificazione.

Pertanto, grazie alla notevole sensibilità della PCR si sono potuti affrontare anche  studi di tipo molecolare proprio su quei tessuti conservati in paraffina rendendo in questo modo possibile l’esecuzione  di ricerche di tipo retrospettivo su materiale conservato, anche da molti  decenni,  negli archivi  dei reparti Universitari e Ospedalieri di Anatomia Patologica  ed è  a  tal proposito, che si è poi sviluppata una nuova tecnica, definita in situ PCR, tecnica  che consente di effettuare l’amplificazione di acidi nucleici direttamente su sezioni di tessuto  incluse in paraffina  per la localizzazione di  sequenze rare.
Il principio di questa metodologia comporta la fissazione del  tessuto (per conservare la morfologia cellulare) e il successivo trattamento con digestione proteolitica (per consentire l’accesso dei reagenti PCR al DNA bersaglio). Dopo amplificazione le sequenze vengono rilevate da  protocolli immunoistochimici standard.  La PCR in situ risulta uno strumento  diagnostico molto attraente per la determinazioni di agenti  infettivi come HIV-1, HPV, HBV, HHV-6, CMV e EBV.

PCR in situ: il DNA o l’RNA vengono amplificati direttamente nelle cellule e nei tessuti morfologicamente intatti

PCR in situ: il DNA o l’RNA vengono amplificati direttamente nelle cellule e nei tessuti morfologicamente intatti

Nel 1991, Eric C. Holland mette a punto una metodologia (PCR high fidelity) che consente di analizzare i prodotti di amplificazione durante la loro sintesi  sfruttando l’attività 5’- 3’ esonucleasica della Taq DNA polimerasi con l’aggiunta alla miscela di reazione PCR di una sonda marcata, complementare alla sequenza bersaglio.
Durante la fase di allungamento della reazione, l’attività esonucleasica della DNA polimerasi determina la degradazione della sonda legata alla sequenza in esame. I frammenti marcati di sonda così rilasciati possono essere discriminati dalle sonde oligonucleotidiche ancora integre. Con questa metodologia  si viene così a migliorare la specificità e la riproducibilità della reazione di PCR.

Eric C. Holland

Eric C. Holland (1959- )

Sempre basandosi sulla tecnica della PCR viene successivamente sviluppata la tecnologia  denominata SSCP (single strand conformational polymorphism o polimorfismo conformazionale su singolo filamento), una tecnica semplice ed efficace per identificare variazioni nella sequenza del DNA amplificato permettendo di discriminare diversi frammenti (amplificati) a singola elica di DNA in base alla diversa mobilità elettroforetica in  gel di poliacrilamide , come conseguenza della diversa conformazione che tali frammenti   assumono, determinata, a sua volta, da una diversa sequenza nucleotidica.
L’analisi dei SSCP era  utilizzata in passato  come metodologia  per individuare nuovi polimorfismi senza  ricorrere  al sequenziamento del DNA ma  in seguito  con il miglioramento del DNA sequencing in termini di efficienza ed accuratezza non  è stata  più adoperata  per  tale scopo.
Per quanto riguarda le caratteristiche generali si tratta   di una  metodica utilizzata ancora oggi, in maniera intensiva, per lo screening di mutazioni puntiformi ereditarie o per  l’identificazione di  mutazioni somatiche nelle  neoplasie permettendo di rivelare locus singoli o loci multipli mediante una sola coppia di primers o più coppie di primers.   Inoltre, risulta  essere un indicatore codominante cioè nel senso che permette  la differenziazione degli  omozigoti dagli eterozigoti in base al diverso numero di bande che si osserveranno  sul gel elettroforetico.
La tecnica SSCP viene anche  utilizzata ampiamente in campo virologico per discriminare la variabilità genetica tra diversi ceppi virali, con l’idea che precise particelle virali presenti in entrambi i ceppi saranno diverse a causa di mutazioni e dunque differenziabili.
Una mutazione puntiforme cioè la variazione di un singolo nucleotide  in una  sequenza di DNA a doppio filamento non può essere distinta per elettroforesi, in quanto le sue proprietà fisiche sono pressoché uguali per entrambi gli alleli.  Dopo  denaturazione il DNA a singolo filamento o ssDNA, ripiegandosi nelle tre dimensioni, viene ad assumere  una conformazione sequenza-specifica. La differenza tra le forme dei due  ssDNA (selvatico o wild type  e mutato) contribuisce a differenziarne la distanza di migrazione su gel durante una corsa elettroforetica, nonostante la lunghezza sia identica.

tecnologia SSCP

SSCP (single strand conformational polymorphism o polimorfismo conformazionale su singolo filamento)

 

 

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