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L’elettroforesi delle proteine in ambito clinico

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di Sergio Barocci

La concentrazione normale delle proteine plasmatiche totali è 6-8 g/dl.

Perché si esegue l’elettroforesi delle proteine?

L’elettroforesi del siero, o anche protidogramma, è una analisi di laboratorio utile per valutare la corretta funzionalità del fegato, la presenza di infiammazioni o infezioni nell’organismo e, addirittura per la diagnosi di malattie più preoccupanti che richiedono ulteriori approfondimenti come il “mieloma multiplo”, o “plasmacitoma”, una neoplasia maligno del sangue.

celle e consumabili per elettroforesi su piastra

celle e consumabili per elettroforesi su piastra

Infatti, nell’organismo umano le uniche proteine che sono facilmente disponibili a scopo di studio sono quelle del sangue nonostante costituiscano solo una piccola frazione di tutte le proteine presenti nell’organismo.  Esse sono estremamente importanti per quanto già stato ribadito per una valutazione clinica, poiché le loro variazioni quantitative e qualitative possono fornire indicazioni molto utili ai fini diagnostici.  Nel plasma sanguigno umano sono presenti molte proteine diverse, sintetizzate in massima parte dal fegato e, per una quota minore, dalle plasmacellule (le immunoglobuline o gli anticorpi), dal sistema monocito/macrofagico (alcuni fattori del complemento) e dalle cellule della parete intestinale (alcune apo-lipoproteine).  Nella diagnostica automatizzata di routine il dosaggio delle proteine del sangue viene effettuato preferenzialmente su campioni di siero al fine di evitare errori quantitativi dovuti alla presenza dei fattori della coagulazione. In condizioni normali, la concentrazione delle proteine sieriche può variare varia da 6 a 8 g/dl.  Se La concentrazione proteica diminuisce si può pensare ad insufficienza epatica, ad una nefrosi con permeabilizzazione deicapillari, a malattie da malassorbimento o ad un ridotto apporto dietetico.
Per differenziare qualitativamente le proteine si esegue un profilo elettroforetico, con il quale le proteine, essendo delle sostanze anfotere in quanto la loro carica netta cambia in funzione del pH, si possono stratificare.  Grazie a questa caratteristica si possono separare elettroforeticamente in base alla mobilità elettroforetica, al punto isoelettrico e alla massa molecolare.
In genere, nella valutazione della funzionalità epatica, questo tipo di test non viene sempre richiesto anche se in grado di fornire indicazioni di tipo quantitativo delle sieroproteine che circolano nel sangue (albumina ridotta e gamma-globuline elevate come accade nelle epatopatie autoimmuni e nelle cirrosi).

forze che condizionano il movimento di uno ione in un campo elettico

forze che condizionano il movimento di uno ione in un campo elettico

Il termine elettroforesi descrive la migrazione di particelle cariche sotto l’influenza di un campo elettrico.  Molte molecole biologiche possiedono (amminoacidi, peptidi, proteine, nucleotidi ed acidi nucleici) gruppi ionizzabili e quindi sono assimilabili a particelle cariche.  Pertanto, sono presenti in soluzione come cationi (+) o anioni (-).
Sotto l’influenza di un campo elettrico queste migrano verso il polo di segno opposto alla loro carica.  Quando si applica una differenza di potenziale (ddp o voltaggio : V) agli elettrodi si genera un gradiente di potenziale E pari a:

E = V/d

Dove d è la distanza tra gli elettrodi.
La velocità di migrazione (v) di una molecola è data da:

v = Eq/f

dove q è la quantità di carica misurata in coulomb
Eq rappresenta la forza che agisce sulla molecola misurata in Newton mentre f rappresenta il coefficiente frizionale ossia la resistenza offerta dal supporto e che rallenta la migrazione.
I seguenti fattori sono quelli che influenzano la migrazione elettroforetica :

  • valore del campo elettrico,
  • grado di ionizzazione delle molecole (ossia il numero delle cariche elettriche possedute),
  • valore del pH del tampone elettroforetico,
  • grandezza peso e forma delle molecole,
  • struttura del supporto di migrazione,
  • forza ionica del tampone elettroforetico,
  • fenomeni di evaporazione,
  • fenomeni di elettroendosmos
unità monomerica di agarosio

Unità ripetuta costituente l’agarosio. Strutturalmente l’agarosio è un polisaccaride formato da unità di D-galattosio e di 3,6-anidro-L-galattosio legate alternativamente con legami glicosidici

Le separazioni elettroforetiche delle siero proteine vengono quasi sempre eseguite su supporti solidi che funzionano come setacci molecolari cioè dei fogli sottili come acetato di cellulosa oppure dei gel di agarosio o dei gel di poliacrilamide. Queste separazioni elettroforetiche vengono poi evidenziate mediante una colorazione specifica (Rosso Ponceau S , Blue di Comassie, Amido Schwarz 10B ect).

Profilo elettroforetico delle sieroproteine su acetato di cellulosa con tracciato densitometrico

Profilo elettroforetico delle sieroproteine su acetato di cellulosa con tracciato densitometrico

L’intensita della colorazione è proporzionale alla quantità di proteine, e viene calcolata tramite densitometro. Dalla scansione densitometrica delle singole frazioni si ottiene un tracciato (profilo) in cui le singole bande sono rappresentate da picchi di diversa altezza e larghezza, la cui area e proporzionale al contenuto proteico delle rispettive frazioni.
Dalla separazione elettroforetica delle proteine sieriche si ottengono delle frazioni principali che corrispondono, partendo dal polo anodico (carico positivamente) fino ad arrivare a quello catodico (carico negativamente).
L’elettroforesi su acetato di cellulosa, che pur essendo una metodica che non raggiunge le risoluzioni ottenibili con i più moderni gel di poliacrilamide ed agarosio, riveste ancora un ruolo in ambito clinico per la valutazione delle proteine del siero ed altre specifiche applicazioni. Si tratta di una metodica relativamente veloci con buona applicabilità in campo diagnostico/clinico (test rapido).

attrezzatura per elettroforesi su acetato di cellulosa

Attrezzatura per elettroforesi su acetato di cellulosa (alimentatore, camera di migrazione o cella elettroforetica, supporto per la deposizione, strisce di acetato di cellulosa)

L’elettroforesi su gel di agarosio e su gel di poliacrilamide offrono una buona risoluzione e vengono comunemente impiegati nei laboratori di ricerca rispettivamente soprattutto per l’analisi degli acidi nucleici e delle proteine. L’elevato tempo richiesto per effettuare una corsa con queste metodiche non li rende attrattivi per quel che concerne un uso diagnostico ad alta processività.

Il fenomeno dell’elettroforesi fu descritto per la prima volta nel 1807 da F. F. Reuss ma il primo dispositivo per eseguire l’elettroforesi fu realizzato da Arne Tiselius nel 1937.

Arne W. K. Tiselius (1902–1971) biochimico svedese vincitore del Premio Nobel per la chimica nel 1948 grazie alle sue ricerche sull’elettroforesi delle proteine contenute nei liquidi biologici.

(a sinistra) Arne Tiselius; (a destra) la struttura della polialcrilamide

(a sinistra) Arne Tiselius; (a destra) la struttura della polialcrilamide

 

 

Elettroforesi zonale su acetato di cellulosa

Il campione di siero (più comunemente rispetto al plasma) viene deposto sulla superficie del supporto di acetato di cellulosa che è imbibito del tampone di corsa e successivamente viene applicata una differenza di potenziale o ddp. Il pH del tampone determina la carica delle molecole che si separano secondo il loro rapporto m/z e l’attrito che incontrano nel muoversi. L’ analisi viene condotta in circa 15’.

protidogramma elettroforetico

In questo tracciato elettroforetico normale si trovano diversi picchi e curve che danno origine a 6 frazioni (da sinistra a destra):  il primo più alto e stretto corrisponde alla banda dell’albumina, seguono poi la banda α1, la banda α2, la banda β1, la banda β2 e la banda . La banda dell’albumina è in posizione anodica ed è quella con maggiore mobilità elettroforetica mentre la banda  è in posizione catodica ed è la più lenta. Gli aumenti o le diminuzioni in altezza o nel numero di tali “picchi” sono da mettere in relazione all’aumento o alla diminuzione patologica o fisiologica delle proteine che li compongono. La concentrazione normale delle proteine plasmatiche totali è di 6-8 g/dl. Più proteine si trovano in una “banda”, più alto è il rispettivo picco. L’altezza corrisponde più o meno alla quantità totale di proteine appartenenti ad una categoria, ma se ad esempio per le gammaglobuline (immunoglobuline IgA, IgD, IgE, IgG, IgM) si volesse conoscere la quantità di ognuna delle diverse classi, si deve ricorrere al dosaggio individuale. Molte di queste proteine vengono prodotte dal fegato, altre sono rilasciate nel sangue dal sistema immunitario.

cella elettroforetica

cella elettroforetica

Le proteine plasmatiche rappresentano degli indicatori molto importanti della funzionalità di molti organi in quanto le alterazioni delle loro quote possono rendere visibile un gran numero di patologie e controllare l’evoluzione di molteplici malattie del fegato, in quanto questo organo produce la maggior parte delle proteine; dei reni, in quanto in condizioni patologiche le proteine possono essere perse con le urine e anche del sistema immunitario perché le gammaglobuline possono essere diminuite nelle immunodeficienze o aumentate nel mieloma multiplo.

In alternativa si può eseguire una elettroforesi capillare.

 

Elettroforesi capillare

La separazione avviene in fase liquida a 24°C per 5’ a 8000 V e le sieroproteine migrano in base alla carica elettrica e alla ripartizione cromatografica sulle pareti del capillare ( si usa un micro capillare in silice fusa riempito da una sostanza che funge da setaccio molecolare) . La rivelazione avviene senza ausilio di coloranti tramite misura dell’assorbanza a 214 nm da parte un detector UV posto alla fine del capillare.

tracciato elettroforetico capillare di sieroproteine

tracciato elettroforetico capillare di sieroproteine

In entrambi i casi si ha lo stesso risultato: le frazioni ottenute mediante elettroforesi si distribuiscono a formare 5 bande o frazioni più o meno eterogenee denominate albumina, alfa-1-globuline, alfa-2-globuline, beta-globuline e gamma-globuline (attualmente molti laboratori effettuano una separazione in 6 bande, con separazione delle beta-globuline in due frazioni, beta-1-globuline e beta-2-globuline: ma non vi sono differenze concettuali dal punto di vista interpretativo).

 

Per la determinazione quantitativa in percentuale delle cinque frazioni, e per il rapporto tra albumina e la somma delle frazioni globuliniche, gli intervalli di riferimento :

  1. albumina 52-69% (3,2 – 5,6 g/dl) ( banda albumina)
  2. α – 1 globuline 1,0 – 6,0% (0,1 – 0,4 g/dl) (banda α1)
  3. α – 2 globuline 4,5 – 14,0 % (0,4 – 1,2 g/dl) (banda α2)
  4. β – globuline 7,0 – 14,0% (0,6 – 1,3 g/dl) ( banda β)
  5. γ – globuline 9,0 – 20 % (0,5 – 1,6 g/dl) ( banda γ)
  6. Rapporto albumina /globuline (1,2÷1.7)

Ognuna della bande separate mediante elettroforesi contiene a sua volta una o più siero proteine:

1.  Albumina
2.  α -1 : alfa-1antitripsina, alfa-1 glicoproteina acida, alfa lipoproteine (HDL) , globulina legante la tiroxina, globulina legante il cortisolo, globulina legante la vitamina B12
3.  α -2 : alfa-2 macroglobulina, aptoglobina (lega l’emoglobina libera) , ceruloplasmina, pre-beta-lipoproteine (VLDL), protrombina, eritropoietina
4.  β -1 : transferrina,betalipoproteine (LDL)
5.  β -2 : fattore C3 del complemento, PCR (Proteina C reattiva)
6.  γ : immunoglobuline (anticorpi)

Determinazione di proteine sieriche specifiche

schema di apparecchiatura per elettroforesi capillare delle proteine

schema di apparecchiatura per elettroforesi capillare delle proteine

Le diverse specie proteiche che costituiscono una singola banda possono poi essere differenziate facendo reagire campioni di plasma con anticorpi policlonali specifici: i complessi antigene-anticorpo che si formano conferiscono al siero una leggera torbidità, che viene quantificata mediante determinazione nefelometrica. Per la determinazione di basse concentrazioni proteiche si ricorre a tecniche più sensibili (tecniche immunometriche) basate sull’uso di anticorpi monoclonali e di specifici indicatori, o traccianti, capaci di rivelare la presenza di complessi antigene-anticorpo: le tecniche più utilizzate a questo scopo sono i metodi enzimo-immunometrici, che utilizzano enzimi come traccianti.

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