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biologia molecolare

Le tecniche per analizzare le possibili alterazioni molecolari degli acidi nucleici (parte II)

di Sergio Barocci

Altre tecniche sviluppate sulla scia della PCR

Sempre a partire dagli anni ’90 la tecnica della PCR viene ancora più perfezionata e automatizzata (termociclatori) al punto da sostituire molte tecniche di clonaggio tradizionale e nello stesso tempo trovano applicazione e si sviluppano altri metodi alternativi o complementari nella ricerca di base, nella diagnostica molecolare e nell’ ambito forense. Si tratta di :

1. metodi di amplificazione del “target”
2. metodi di amplificazione del segnale

termociclatoreEsempio di Thermal cycler o Termociclatore: si tratta di uno strumento di laboratorio in grado di condurre automaticamente determinate variazioni cicliche di temperatura necessarie all’amplificazione enzimatica di sequenze di DNA in vitro attraverso la PCR. E’ costituito da un blocco termico per alloggiare i campioni da amplificare , in genere contenuti in provette tipo eppendorf e da un sistema in grado di aumentare o ridurre la temperatura del blocco in base alle istruzioni fornite da un programma di amplificazione . Alcuni di questi modelli sono in grado di effettuare gradienti termici all’interno del blocco termico, nel caso di utilizzazione di temperature di annealing differenti per una determinata coppia di primer. I dispositivi più moderni sono dotati di un coperchio riscaldato che, premendo sui tappi delle provette eppendorf , impedisce la formazione di condensa nella parte superiore dei tubi di reazione. Continua...

Le tecniche per analizzare le possibili alterazioni molecolari degli acidi nucleici (parte I)

di Sergio Barocci

termociclatoreMolte delle tecniche utilizzate tra la fine degli anni ’70 e l’inizio degli anni ’80 prima cioè della scoperta della PCR erano poco standardizzate.  Presentavano grandi variabilità di efficienza tra i vari laboratori e i risultati ottenuti mostravano molte volte delle difformità.  In aggiunta l’esecuzione di queste tecniche richiedeva  spesso attrezzature e competenze che non erano facilmente disponibili nei vari laboratori diagnostici.
In quel periodo le tecnologie disponibili  per analizzare possibili alterazioni molecolari di acidi nucleici associate a patologie umane erano rappresentate soprattutto da tecniche quali il “Southern blot” e il “Northern blot”, rispettivamente per l’analisi del DNA e dell’RNA, la digestione enzimatica del DNA con gli enzimi di restrizione, il sequenziamento di frammenti di DNA,

Ad esempio, la metodica del “Southern blot”, messa a punto da E. Southern per la caratterizzazione sia di DNA genomico che di DNA clonato, richiedeva l’estrazione di un certo quantitativo in microgrammi (µg) di DNA da campioni biologici come cellule eucariotiche o procariotiche, tessuti o ancora fluidi biologici che non doveva essere degradato, cioè che doveva conservare la struttura complessa del DNA di partenza.

Successivamente, fu necessaria una fase di digestione del DNA mediante trattamento con enzimi di restrizione cioè quegli enzimi  in grado di tagliare il DNA all’altezza di sequenze nucleotidiche ben definite.  Continua...

I vari tipi di RNA e le eccezioni del Dogma Centrale

di Sergio Barocci

RNA

Struttura e Funzioni

L’RNA (acido ribonucleico), rispetto al DNA, presenta 2 principali differenze:
     1)   Lo zucchero è il ribosio;
     2)   Al posto della timina c’è l’uracile (base pirimidinica) che si lega con l’adenina (base purinica).

Promemoria definizioni:
Nucleoside = base + zucchero    |    Nucleotide = base + zucchero + fosfato

Si conoscono tre tipi di RNA:
• l’RNA messaggero (mRNA): trasferisce le informazioni dal DNA localizzato nel nucleo al citoplasma dove avviene la sintesi proteica;
• l’RNA transfer (tRNA): recluta gli aminoacidi per inserirli nella proteina neosintetizzata che viene composta durante la sintesi proteica;
• l’RNA ribosomiale (rRNA): costituente principale dei ribosomi.

I ribosomi sono i componenti essenziali nella sintesi proteica.  Sono organelli cellulari costituiti da rRNA e proteine e sono formati da una subunità piccola 40S (“S” è l’unità di misura indicante la velocità di sedimentazione) e una subunità grande da 60S, che si possono unire per formare un unico complesso ad alto peso molecolare da 80S.
La subunità grande contiene gli rRNA 28S, 5.8S e 5S oltre a circa 50 proteine, mentre la subunità piccola contiene l’rRNA 18S e circa 30 proteine.
L’RNA o acido ribonucleico è un altro biopolimero presente negli organismi viventi.   Continua...

La struttura degli acidi nucleici (e le loro varianti)

di Sergio Barocci

prosegue, dell0 stesso Autore, dall’articolo:  “Gli acici nucleici: dalla cromatina ai nucleotidi” ]

I nucleotidi del DNA e dell’RNA sono uniti tra loro da ponti covalenti tra gruppi fosforici in cui il gruppo OH 5’ di un’unità nucleotidica è unito al gruppo OH 3’ di quella successiva, formando un legame fosfodiestereo (reazione di condensazione tra il gruppo fosforico di un nucleotide e l’ossidrile sul carbonio 3’ dello zucchero di un altro nucleotide costituendo così un polinucleotide ( legami 3’ – 5’ fosfodiesterici ) . Per convenzione, un polinucleotide si scrive con il carbonio terminale 5’ a sinistra e quello 3’ a destra.
Lo scheletro covalente degli acidi nucleici è quindi costituito da un’alternanza di gruppi fosforici e di residui di pentosio, mentre le basi azotate possono essere considerate come gruppi laterali uniti allo scheletro. Lo scheletro covalente del DNA e dell’RNA è idrofilico.

Pertanto, ciò che differenzia un nucleotide dall’altro è appunto la diversa base che lo costituisce e la sequenza in cui sono disposte le basi è quella che determina il codice genetico dell’individuo.3’ manca di un nucleotide nella posizione 3’

Le proprietà delle basi dei nucleotidi determinano la struttura tridimensionale degli acidi nucleici.   Continua...

Gli acidi nucleici: dalla cromatina ai nucleotidi

di Sergio Barocci

GLI ACIDI NUCLEICI
E L’ORGANIZZAZIONE DELLA CROMATINA EUCARIOTICA

Gli acidi nucleici sono macromolecole polimeriche lineari ossia dei polimeri di nucleotidi i cui monomeri sono i nucleotidi stessi. Hanno grande importanza a livello biologico in quanto contengono e trasportano tutta l’informazione genetica di un organismo. Data la loro funzione si trovano principalmente all’interno del nucleo , la zona maggiormente protetta della cellula ma in misura minore anche nel citoplasma. Negli organismi viventi si trovano due tipi di acidi nucleici:
a) DNA (acido desossiribonucleico o deossiribonucleico)
b) RNA (acido ribonucleico)

Nelle cellule procariote (dove non esiste il nucleo) tutte le informazioni sono contenute in una sola molecola di DNA circolare mentre nelle cellule eucariote il DNA si trova all’interno del nucleo in una forma detta cromatina, che consiste sostanzialmente di filamenti di DNA ripiegati in molti modi diversi attorno a delle proteine chiamate istoni (H1, H2A, H2B, H3, H4) , formando delle strutture piuttosto complicate, i cromosomi, caratteristici per forma e numero.   Gli istoni possiedono un alto contenuto di catene laterali cariche positivamente e circa un residuo ogni quattro è rappresentato da lisina o da arginina.   Ciascun tipo di istone può esistere in una varietà di forme a causa di modificazioni post-traduzionali.   Continua...

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