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sequenziazione DNA

Le tecniche per analizzare le possibili alterazioni molecolari degli acidi nucleici (parte II)

di Sergio Barocci

Altre tecniche sviluppate sulla scia della PCR

Sempre a partire dagli anni ’90 la tecnica della PCR viene ancora più perfezionata e automatizzata (termociclatori) al punto da sostituire molte tecniche di clonaggio tradizionale e nello stesso tempo trovano applicazione e si sviluppano altri metodi alternativi o complementari nella ricerca di base, nella diagnostica molecolare e nell’ ambito forense. Si tratta di :

1. metodi di amplificazione del “target”
2. metodi di amplificazione del segnale

termociclatoreEsempio di Thermal cycler o Termociclatore: si tratta di uno strumento di laboratorio in grado di condurre automaticamente determinate variazioni cicliche di temperatura necessarie all’amplificazione enzimatica di sequenze di DNA in vitro attraverso la PCR. E’ costituito da un blocco termico per alloggiare i campioni da amplificare , in genere contenuti in provette tipo eppendorf e da un sistema in grado di aumentare o ridurre la temperatura del blocco in base alle istruzioni fornite da un programma di amplificazione . Alcuni di questi modelli sono in grado di effettuare gradienti termici all’interno del blocco termico, nel caso di utilizzazione di temperature di annealing differenti per una determinata coppia di primer. I dispositivi più moderni sono dotati di un coperchio riscaldato che, premendo sui tappi delle provette eppendorf , impedisce la formazione di condensa nella parte superiore dei tubi di reazione. Continua...

Le tecniche per analizzare le possibili alterazioni molecolari degli acidi nucleici (parte I)

di Sergio Barocci

termociclatoreMolte delle tecniche utilizzate tra la fine degli anni ’70 e l’inizio degli anni ’80 prima cioè della scoperta della PCR erano poco standardizzate.  Presentavano grandi variabilità di efficienza tra i vari laboratori e i risultati ottenuti mostravano molte volte delle difformità.  In aggiunta l’esecuzione di queste tecniche richiedeva  spesso attrezzature e competenze che non erano facilmente disponibili nei vari laboratori diagnostici.
In quel periodo le tecnologie disponibili  per analizzare possibili alterazioni molecolari di acidi nucleici associate a patologie umane erano rappresentate soprattutto da tecniche quali il “Southern blot” e il “Northern blot”, rispettivamente per l’analisi del DNA e dell’RNA, la digestione enzimatica del DNA con gli enzimi di restrizione, il sequenziamento di frammenti di DNA,

Ad esempio, la metodica del “Southern blot”, messa a punto da E. Southern per la caratterizzazione sia di DNA genomico che di DNA clonato, richiedeva l’estrazione di un certo quantitativo in microgrammi (µg) di DNA da campioni biologici come cellule eucariotiche o procariotiche, tessuti o ancora fluidi biologici che non doveva essere degradato, cioè che doveva conservare la struttura complessa del DNA di partenza.

Successivamente, fu necessaria una fase di digestione del DNA mediante trattamento con enzimi di restrizione cioè quegli enzimi  in grado di tagliare il DNA all’altezza di sequenze nucleotidiche ben definite.  Continua...

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