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termociclatore

Le tecniche per analizzare le possibili alterazioni molecolari degli acidi nucleici (parte II)

di Sergio Barocci

Altre tecniche sviluppate sulla scia della PCR

Sempre a partire dagli anni ’90 la tecnica della PCR viene ancora più perfezionata e automatizzata (termociclatori) al punto da sostituire molte tecniche di clonaggio tradizionale e nello stesso tempo trovano applicazione e si sviluppano altri metodi alternativi o complementari nella ricerca di base, nella diagnostica molecolare e nell’ ambito forense. Si tratta di :

1. metodi di amplificazione del “target”
2. metodi di amplificazione del segnale

termociclatoreEsempio di Thermal cycler o Termociclatore: si tratta di uno strumento di laboratorio in grado di condurre automaticamente determinate variazioni cicliche di temperatura necessarie all’amplificazione enzimatica di sequenze di DNA in vitro attraverso la PCR. E’ costituito da un blocco termico per alloggiare i campioni da amplificare , in genere contenuti in provette tipo eppendorf e da un sistema in grado di aumentare o ridurre la temperatura del blocco in base alle istruzioni fornite da un programma di amplificazione . Alcuni di questi modelli sono in grado di effettuare gradienti termici all’interno del blocco termico, nel caso di utilizzazione di temperature di annealing differenti per una determinata coppia di primer. I dispositivi più moderni sono dotati di un coperchio riscaldato che, premendo sui tappi delle provette eppendorf , impedisce la formazione di condensa nella parte superiore dei tubi di reazione. Continua...

La replicazione artificiale del DNA: la PCR

di Sergio Barocci

La reazione polimerasica a catena o PCR

postazione di lavoro in cappa per PCRDa quando è stata ottenuta la duplicazione del DNA in laboratorio, è stato possibile fare copie multiple di una sequenza di DNA.  La reazione a catena della polimerasi o PCR da Polymerase Chain Reaction è una tecnica che automatizza questo processo copiando molte volte in provetta un tratto di DNA.  Tale tecnica è stata inventata dal biochimico americano Kary Mullis nel 1983 per la quale ottenne poi il Premio Nobel per la Chimica nel 1993 .  La reazione riproduce praticamente ciò che avviene nel nucleo delle cellule, ossia la replicazione del DNA, eseguita in modo artificiale.
Per allestire una reazione di PCR è necessario disporre di strumenti come un termociclatore, che è una sorta di fornetto in cui si dispongono dei campioni, solitamente posti in una pluripiastra a 96 pozzetti.

La reazione ha la funzione di amplificare un determinato tratto di materiale genetico ottenendone più copie dello stesso.  Al fine di rendere possibile tale procedimento è necessario preparare un campione contenente :
a)  il frammento di DNA da amplificare, presente come doppio filamento,
b)  oligonucleotidi liberi trifosfato, che occorrono come materia prima per sintetizzare i nuovi filamenti che saranno le copie del filamento iniziale,
c)  dei Primers (uno Forward e uno Reverse), che vengono disegnati in base a determinati software (che si possono scaricare da Internet come Free Download), che occorrono come iniziatori del processo di estensione dei filamenti, ossia come prontuario,
d) un enzima che provvede all’estensione dei filamenti, denominato Taq Polimerasi, ossia una DNA polimerasi Termoresistente estratta dal microrganismo, appartenente al Regno degli Archaea, Thermus acquaticus. Continua...

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